中华人民共和国国家标准
GB/T 35332-2017
Detection and identification of Gra pevine virus A
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局. 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、福建省农业科学院、中华人民共和国江苏出入境检验
本标准主要起草人：张永江、谢画雪、李彬、魏梅生、李桂芬、马洁、辛言言、张晓雷、吴兴海、朱水芳.
葡萄A病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了葡萄A病毒（GrapevineirasA）的检疫鉴定方法.本标准适用于可能携带葡萄A病毒的葡萄苗木、接穗、砧木、插条等繁殖材料的检疫鉴定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法
3葡萄A病毒基本信息
缩写：GVA.异名：葡萄茎痘相关病毒（Grapevine stem pitting-associatedvirus）.分类地位：β线形病毒科（Betaflexiviridae），葡萄病毒属（Virivirus）.
学名：Grapevine viras A.
GVA的其他信息参见附录A.
4方法原理
GVA的蛋白和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据.根据GVA与抗体之间的特异性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）和免疫电镜检测：依据GVA的基因组特征建 立RT-PCR、实时荧光RT-PCR；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有GVA.
5仪器、用具及试剂
5.1仪器
冰机、旋涡振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶 电子天平（感量0.001g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱（一80C）、制成像分析仪、酵标仪、透射电子显微镜.
5.2用具
酶联板、可调移液器（2.5pL、10 pL、20 pL、100pL、200μL、1 000 pL）和可调移液器头、离心管、研、微型磨等.
5.3试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定.DAS-ELISA试剂
GB/T 35332-2017
见附录B；RT-PCR检测试剂见附录C：实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D：免疫电镜检测试剂见SN/T 1840
6样品制备
良好具症状的叶片1g单独制样，用于后续检测；无明显症状的，可5株混合采样用于后续检测. 将葡萄种苗种植于隔离温室中，在生长期间进行严格的症状检查.对可疑症状的植株，采基部发育
7检测鉴定
7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）
到两个孔中.健康的植物组织作为阴性对照，感染GVA的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作 把制备的样品上清液加入已包被GVA抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测.每个样品平行加为空白对照；其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致.
具体操作见附录B.
7.2免疫电镜检测
免疫电镜检测方法见SN/T1840.
7.3RT-PCR 检测
RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录C.
7.4实时荧光RT-PCR检测
实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D.如采用商品化一步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行.
8结果判定
样品检测时，检测流程及结果判定按下述原则进行：
采用DAS-ELISA或免疫电镜方法进行检测，若：
检测结果为阳性时：
RT-PCR的检测结果为阳性，则判定样品携带GVA；
或用实时荧光RT-PCR进行检测，若检测结果为阳性，则判定样品携带GVA
检测结果为阴性时：
RT-PCR的检测结果为阴性，则判定样品不携带GVA：检测结果为阳性，则对产物进行测序，测定的序列为GVA序列，则判定样品携带GVA：
9样品保存与结果记录
9.1样品保存
经检测确定携带GVA的样品应保存在适合的条件下以备复核.活体的病株在隔离温室中保存，其他的离体材料如叶片等样品可保存在一80℃冰箱中：做好登记和标记工作，保存期限至少1年.
9.2结果记录
记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字.DAS-ELISA检测应有酵联反应数值；免疫电镜检测应有电镜图片；RT-PCR检测应有电泳图片：实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图.
