GB 中华人民共和国国家标准 GB31655—2021 食品安全国家标准 哺乳动物体内碱性彗星试验 2021-02-22发布 2021-08-22实施 中华人民共和国国家卫生健康委员会 发布 国家市场监督管理总局 GB31655—2021 食品安全国家标准 哺乳动物体内碱性彗星试验 1范围 本标准规定了哺乳动物体内碱性营星试验的基本试验方法和技术要求. 本标准适用于评价受试物对哺乳动物组织细胞的DNA损伤作用. 2术语和定义 2.1彗星 受损DNA片段受到电场作用后产生的拖尾现象，在显微图像下形似“彗星”.彗星头是核DNA 彗星尾由在电场中迁移出核的受损DNA片段组成. 2.2可评分细胞 有清晰轮廓的彗星头、尾，且未受邻近细胞干扰的细胞. 2.3“刺猬”状细胞 显微图像下由小或模糊不清的头以及大的弥漫性尾组成的细胞. 2.4尾部DNA百分比 彗星尾部DNA含量相对于总DNA含量（头、尾之和）的比值.它反映了DNA损伤的相对程度， 以百分比表示. 2.5关键变量 小的改变会对试验结果产生较大影响的试验参数，包括取材时间、裂解条件、电泳时间等.关键变 量可以是组织特异性的. 3试验目的和原理 哺乳动物体内碱性彗星试验可用于检测强碱性条件下(PH≥13)DNA单链和双链的断裂，包括受 试物直接作用引起的DNA链断裂、碱性不稳定性位点引起的DNA链断裂和DNA切割修复所引起的 瞬时DA链断裂.动物通过适当的途径给予受试物.在实验终点，解剖分离靶组织，制备单细胞/细 胞核悬浮液嵌入软琼脂并固定在载玻片上，除去细胞膜和/或核膜后暴露在强碱性条件下(H≥13)，使 DNA解旋并释放游离的DNA环和片段.核DNA进行琼脂糖凝胶电泳.未损伤的DNA保留在琼脂 糖凝胶的原位置形成替星头部（替头），由DNA链断裂造成的损伤DNA片段和游离的DNA环向阳极 迁移形成彗星尾部（彗尾）. 1 GB31655—2021 4仪器和试剂 4.1仪器/器械 实验室常用解剖器械、电子天平、制冰机、离心机、微波炉、水浴锅、磨砂玻片、电泳仪、水平电泳槽、 荧光显微镜、彗星成像和图像分析系统等. 4.2试剂/溶液 4.2.11.0%~1.5%(w/V)基底层标准琼脂糖凝胶：常规熔点琼脂糖经微波炉加热溶于磷酸盐缓冲液 (pH7.0~7.4 不含Ca2、Mg2和酚红)，制成1.0%~1.5%(w/V)标准琼脂糖凝胶. 4.2.20.5%(w/V)细胞层和顶层低熔点琼脂糖凝胶：低熔点琼脂糖经微波炉加热溶于磷酸盐缓冲液 (PH7.0~7.4 不含Ca2、Mg2和酚红)，制成0.5%(w/V)低熔点琼脂糖凝胶.试验期间置于37℃~ 45℃水浴锅中保温. 4.2.3裂解液：称取乙二胺四乙酸二钠（分析纯）、氯化钠（分析纯）和三羟甲基氨基甲烷（分析纯），用纯 水配制成溶液（终浓度为乙二胺四乙酸二钠0.1mol/L、氯化钠2.5mol/L、三羟甲基氨基甲烷 0.01mol/L).调节pH为10.0 10℃以下冷藏保存.使用当天加入triton-X100和二甲基亚砜，终浓 度分别为1%(V/V)和10%(V/V) 使用前10℃以下冷藏至少30min. 4.2.4电泳缓冲液：称取乙二胺四乙酸二钠和氢氧化钠（分析纯），用纯水配制成溶液（终浓度为乙二胺 四乙酸二钠0.001mol/L、氢氧化钠0.3mol/L) 现用现配，调节pH 使pH≥13，使用前10℃以下冷藏 保存. 4.2.5中和缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷（分析纯），用纯水配制成溶液，终浓度为0.4mol/L 调节 pH为7.5，使用前10℃以...
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