SN/T5276-2020
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。
本标准起草单位：中华人民共和国上海海关、中国检验检疫科学研究院。
本标准主要起草人：古淑青、邓晓军、陈额、张九凯、赵超敏、时逸吟、陈念念、曲栗、韩丽。
SN/T 5276-2020
出口食品中多种过敏原的测定 液相色谱-质谱/质谱法
1范围 本标准规定了加工食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生和坚果过级原蛋白的液相色谱-质谱/质谱检 测方法。
本标准适用于饼干、面包、饮料、早餐谷物等食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁和 核桃过敏原蛋白的液相色谱-质谱/质谱测定和确证。
2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3方法原理 试样中过敏原蛋白质经提取和纯化，二硫苏糖醇（DDT）还原，碘代乙酰胺（IAA）烷基化，碱 性胰蛋白酶酶解，液相色谱-质谱/质谱检测。
建立特征肽段的响应强度与过敏原含量的线性关系， 外标法定量。
4试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。
4.1试剂 4.1.1碳酸氢铵（NH,HCO，）。
4.1.2二硫苏糖醇（CHOS.DTT）。
4.1.3碘代乙酰胺（ICHCONH，IAA）。
4.1.4氯化钙（CaCl）。
4.1.5乙酸（CH,COOH）：色谱纯。
4.1.6甲酸（HCOOH）：色谱纯。
4.1.7乙晴（CH,CN）：色谱纯。
4.1.8碱性胰蛋白酶：活力大于10000BAEE每毫克蛋白质。
4.1.9三羟甲基氨基甲烷（C,HNO，Tris）。
4.1.10盐酸（HCI）。
4.1.11正己烷（CH）：色谱纯。
SN/T 5276-2020 4.2试剂配制 4.2.1碳酸氢铵溶液（500mmol/L）：称取3.95g碳酸氢铵（4.1.1），用水溶解后定容至100ml。
4.2.2二硫苏糖醇溶液（500mmol/L）：称取0.771g二硫苏糖醇（4.1.2），用碳酸氢铵溶液（4.2.1） 溶解后定容至10mL。
4℃冷藏可保存一个月。
4.2.3碘代乙酰胺溶液（500mmol/L）：称取0.925g碘代乙酰胺（4.1.3），用碳酸氢铵溶液（4.2.1） 溶解后定容至10mL。
4℃避光冷藏保存一个月。
4.2.4氯化钙溶液（100mmol/L）：称取0.111g氯化钙（4.1.4），用水溶解后定容至10ml。
4.2.5乙酸溶液（1%，体积比）：移取0.1mL乙酸（4.1.5），用水稀释并定容至10mL 解后定容至10mL。
溶液于-20℃可保存6个月。
4.2.7甲酸的水溶液（0.1%，体积比）：准确移取1.0mL甲酸（4.1.6），用水定容至1000mL。
4.2.8甲酸的乙晴溶液（0.1%，体积比）：准确移取1.0mL甲酸（4.1.6），用乙睛（4.1.7）定容至 1 000 ml 4.2.9Tris-HCl溶液（40mmol/L）：称取2.42gTris（三羟甲基氨基甲烷），溶解于800mL水中，用 10%盐酸调节pH至8.0±0.10，用水定容至1000mL。
4.3标准品 4.3.1NISTSRM 8445：用于过敏原检测的喷雾干燥的全蛋粉（spraydrired wholeggforallren detetion）。
4.3.2NIST SRM 2387:花生酱（peamut buller )。
4.3.3NIST SRM 1549a :全脂奶粉 ( whole milk powder )。
4.3.4NISTSRM 3234：大豆粉（soy four)。
（或其他来源的标准参考物质也可以。
） 4.4标准溶液配制 4.4.1NIST SRM 8445、SRM 2387、SRM 1549a、SRM 3234蛋白提取液标准储备液：分别准确称 取1gNIST SRM 8445、SRM 2387.SRM1549a、SRM 3234，加入Tris-HC1（4.2.9）溶液，定容至20 mlL。
振荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅60C加热振荡提取3h。
提取液以10000r/min高速离心 5 min，上清液过低蛋白质吸附的0.45 μum 醋酸纤维滤膜后，用Bradford方法测定提取液中总蛋白的浓 度，提取液置于-20℃冰箱内保存。
4.4.2因难以购买到标准物质，实验中分别准确称取1g烘培后的榛子、核桃、杏仁、加人Tris-HCl （4.2.9）溶液，定容至20mL。
振荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅60C加热振荡提取3h。
提取 液以10 000 r/min高速离心5min，上清液过低蛋白质吸附的0.45μum醋酸纤维滤膜后，用Bradford方 法测定提取液中总蛋白的浓度，提取液置于-20℃冰箱内保存。
4.4.3系列标准工作溶液：准确移取适量的标准蛋白提取储备液，用空白基质溶液配制成最终浓度 为含全脂奶粉、鸡蛋：5mg/L、10 mg/L、20 mg/L、100 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L，花生、大豆、 榛子、杏仁、核桃：10mg/L、20mg/L、40mg/L、200 mg/L、800mg/L、1600mg/L的基质匹配标准工 作溶液。
5仪器和设备 5.1液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子（ESI）源。
5.2分析天平：感量为0.01mg、0.001g、0.1g。
5.3恒温水浴锅。
2
SN/T 5276-2020 5.4离心机：转速不低于4000r/min。
5.5离心管：50mL具塞塑料离心管，超滤离心管（10kDa截止膜），1.5mL低蛋白吸附离心管。
5.6微孔滤膜：水相，0.22pm。
6试样制备与保存 6.1试样制备 6.1.1饼干、面制品、饮料、麦片 取有代表性样品500g（精确至0.1g），采用粉碎机粉碎后，再将其研磨成细粉状，装人洁净的 盛样容器内，密封并标明标记。
6.1.2婴幼儿配方食品（不包括配方乳粉） 取有代表性样品500g（精确至0.1g），装人洁净的盛样容器内，密封并标明标记。
6.2试样保存 在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。
7分析步骤 7.1试样前处理 称取混合均匀的固体试样约2.0g或液体试样约10g（精确至0.001g）.于50mL具塞塑料离心管 中。
对于脂肪含量高的样品，加入10mL正已烷（4.1.11），涡旋3min后，4500r/min离心5min，除 去上层溶液。
重复两次后，氮气吹干。
加人20mLTris-HCl溶液（4.2.9）.振荡均匀使试样完全溶解， 置于水浴锅60C加热振荡提取3h。
提取液以10000r/min高速离心5min，取上清液过低蛋白质吸附 的0.22μum醋酸纤维滤膜。
取上述蛋白粗提液2mL加入带有分子量10kDa截止膜的超滤离心管（5.5）中，以10000r/min 高速离心15min，超滤去除小分子杂质；再向超滤离心管中加人500uLTris-HCl溶液（4.2.9），润洗 超滤膜，以10000r/min高速离心至膜上剩余液体约200gL，剩余体积可以从超滤管侧壁的刻度读取， 将膜上液体收集至1.5mL的低蛋白吸附离心管中（5.5）。
7.2烷基化与酶解 向上述离心管中，加人150μL碳酸氢铵溶液（4.2.1）、10μL二硫苏糖醇溶液（4.2.2），混匀后置 75°℃C下恒温水浴30min；冷却至室温，加人30μL碘代乙酰胺溶液（4.2.3），暗处静置30min；再加 入10μL氯化钙溶液（4.2.4）、50μL牛胰蛋白酶溶液（4.2.6），充分混匀后置于37℃C恒温水浴中酶解 5h（5.6）。
用10μL甲酸（4.1.6）混匀，室温下静置15 min，加水定容至1mL，涡旋混匀，用0.22 μum 滤膜过滤，供液相色谱申联质谱仪检测。
7.3仪器参考条件 7.3.1液相色谱条件 液相色谱条件如下： a）色谱柱：Cs柱，100mm×2.1 mm（内径），填料粒径1.7μm，孔径30mm（300A）或性能 相当者：
SN/T 5276-2020 b）柱温：40℃； c）流动相：A，0.1%的甲酸-水溶液（体积比）.B：0.1%的甲酸-乙晴溶液（体积比）。
梯度 洗脱程序见表1； d）流速：0.4ml/min ; e）进样量：10gl。
表1梯度洗脱程序 时间/minA/% B/% 0.097.03.0 1.097.03.0 10.070.030.0 13.045.055.0 13.120.080.0 16.020.080.0 16.197.03.0 20.097.03.0 7.3.2质谱条件 质谱条件如下： a）电离方式：电喷雾电离，正离子： b）扫描方式：多反应监测（MRM）； c）雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体，使用前应调节各气 体流量以使质谱灵敏度达到检测要求，质谱参考条件参见附录A； d）特征肽段的多反应监测（MRM）色谱图参见附录B。
7.4测定 7.4.1定性测定 试样中目标物色谱峰的保留时间与相应基质匹配标准溶液色谱峰的保留时间相比较，变化范围 应在±2.5%以内。
样品中待测物的质谱定性离子与定量离子的比例应当与浓度相当标准工作溶液的相对离子比例 一致、相对离子比例允许偏差不超过表2规定的范围。
表2定性确证时相对离子比例的最大允许偏差 相对离子比例/%>500S<0 ~ 01<≤10 允许的相对偏差/%±25± 30± 50 7.4.2定量测定 在仪器最佳工作条件下，对基质匹配标准工作溶液进样，外标法定量。
标准工作液和样液中待测 物的响应值均应在仪器线性响应范围内。
对于同时有多个特征肽段的过敏原物质，应根据质谱响应选 择最佳肽段用于定量，其余肽段用于辅助过敏原物质定性。
标准品全扫描色谱图参见附录A中图A.1。
4...
