B 43 ICS_65.020.30
NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T1898-2010
畜禽线粒体DNA遗传多样性 检测技术规程 Protocol'of detectionformitochondrialDNAgenetic diversity ofdomesticanimals
2010-07-08发布2010-09-01实施 中华人民共和国农业部发布
NY/T1898-2010
前言
本标准遵照GB/T1.1一2009给出的规则起草。
本标准由中华人民共和国农业部畜牧业司提出。
本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。
本标准起草单位：全国畜牧总站。
本标准主要起草人：王志刚、刘丑生、邱小田、张桂香、韩旭、于福清、孙飞舟。
NY/T1898-2010
畜禽线粒体DNA遗传多样性检测技术规程
1范围 本标准规定了畜禽线粒体DNA遗传多样性检测的技术规程。
本标准适用于畜禽线粒体DNA遗传多样性检测。
2规范性引用文件 下列文件对于本文本的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单)适用于本文件。
GA/T383法庭科学DNA实验室检验规范 NY/T1673畜禽微卫星DNA遗传多样性检测技术规程 3术语和定义 下列术语、定义和缩略语适用于本文件。
3. 1 线粒体DNAmitochondrialDNA,mtDNA 动物细胞核外唯一具有半自主能力的双链环状DNA。
3.2 线粒体DNAD-loop区mt DNAD-loop 动物线粒体DNA翻译和转录的调控区和唯一的非编码区，当线粒体DNA开始复制时，此区外形 呈D形。
4检测方法 4.1样品的采集和保存 4.1.1在中心产区采样，个体应具备该种群的典型特征，样品的采集及保存应满足提取DNA的要求， 并详细记录材料名称、来源、系谱、采集时间、地点及保存条件。
血缘关系。
4.2DNA的制备 制备DNA的方法按NY/T1673的规定执行。
4.3引物制备 4.3.1引物合成 根据相关畜禽线粒体基因组序列设计引物，并合成。
4.3.2工作液配制 将合成的引物瞬时离心，加入灭菌超纯水充分震荡，配成浓度为100pmol/μL的储液，室温溶解30 min，分装，一20℃保存，储液稀释10倍即为工作液。
其中加人灭菌超纯水的体积V(gL)按式(1)计算： V=33×OD×10........... MW
1
NY/T 1898-2010 式中： MW--引物分子量； OD一DNA260nm吸收的光密度。
4.4PCR反应体系 PCR反应体系见附录A.1。
4.5PCR反应程序 PCR反应程序见附录A.2。
4.6扩增产物的检测与回收 凝胶电泳法检测PCR产物，扩增效果良好的样品按附录B纯化回收，按附录C测序。
5数据分析 序列比对、单倍型统计、系统发生树构建等数据分析参见附录D。
6防污染措施 按GA/T383规定的方法执行。
7对照实验 设立阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照为线粒体DNA样品，阴性对照为不具有细胞核 DNA样品，空白对照为等量双蒸水。
NY/T 1898-2010
附录A (规范性附录） PCR反应体系和程序
A.1PCR反应体系见表A.1 表A.1PCR反应体系 组分及浓度使用量 Buffer(10×)5. 0 μL MgCl; (25 mmol/ L)1pL~4 pL 引物 P1A(10 pmol/ μL)2.0 μL 引物P1B(10 pmol/ μL)2.0μL dNTPs(10 mmol/ L)1 μL Taq E(5 U/ μL)0.2pL DNA样品50 ng~100 ng O°HPP加至50 pL A.2PCR反应程序见表A.2 表A.2PCR反应程序 阶段温度，℃时间 预变性954 min
9420 s~60 s 25个~35个循环50~6530 s~60 s
7230 s~90 s 延伸72℃ 10 min~70 min 保存4℃
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