附件2 鸡传染性法氏囊病活疫苗中非法添加/ 改变制苗用毒种检测方法 1.适用范围 1.1本方法适用于鸡传染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改 变制苗用毒种的检测. 1.2非法添加/改变制苗用毒种的检测范围为鸡传染性法氏 囊病病毒超强毒株、中等毒力及中等偏强毒力毒株、弱毒力毒株、 变异株的鸡传染性法氏囊病病毒核酸. 2.试验材料 2.1引物 针对鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus IBDV)不同毒力毒株基因序列差异区，参考WOAH《陆生动物诊断 试验与疫苗手册》第3.3.12鸡传染性法氏囊病，设计VP2高变区 的一对通用引物. Upper U3:5’-GCATGCGGTATGTGAGGCTTGGTGAC-3’ Lower L3:5'-GAATTCGATCCTGTTGCCACTCTTTC-3' 2.2阳性对照 鸡传染性法氏囊病病毒阳性对照分别为： 超强毒株代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(SD1205E5株)，毒 -8 种编号为CVCC AV358 来源于国家兽医微生物菌（毒）种保藏 中心； 中等毒力及中等偏强毒力代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒 (CF株)，毒种编号为CVCC AV164 来源于国家兽医微生物菌 (毒)种保藏中心；鸡传染性法氏囊病病毒(NF8株)，来源于乾元 浩生物股份有限公司南京生物药厂； 弱毒力毒株代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(B87株)，毒种 编号为CVCC AV140 来源于国家兽医微生物菌（毒）种保藏中心； 变异株代表毒株鸡传染性法氏囊病病毒(LN2023株)，毒种编 号为CVCC AV1570 来源于国家兽医微生物菌（毒）种保藏中心. 2.3试剂 RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂、DNA片段回收试剂盒、限制 性内切酶Eagl-HF和StuI、琼脂糖、50xTAE、DNA marker、无核酸酶 水、生理盐水. 3.检测方法 3.1样品稀释 取疫苗按瓶签标示，用生理盐水稀释至每毫升至少含10 羽份. 阳性对照病毒含量至少应为100ELD50/0.1ml. 阴性对照：生理盐水或无菌水. 3.2RNA提取 将稀释后的疫苗和阴、阳性对照按商品化核酸提取试剂盒进 -9- 行RNA核酸提取. 3.3RT-PCR反应 将3.2步骤提取的RNA进行反转录操作.RT-PCR反应程序 如下：第一阶段，反转录，用六聚体随机引物作为反转录引物获得 cDNA 在0.2 ml PCR管中加入：RNA8uL random hexamers(50ug uL)1uL 10 mM dNTP mix1puL 沸水浴5min 冰浴2min;再加入 10 L cDNA合成预混液，反应体系见表1. 表1cDNA合成预混液成分(10μL) 试剂 体积(uL) 10xRT buffer 2 25mM Mgcl2 4 0.1M DTT 2 RNaseOUT(40U/uL) 1 SuperScript IⅢ 1 反转录反应条件：25℃10min;50℃50min;85℃5min. 第二阶段，95℃3min;95℃40s 60℃30s 72℃40s 30个循环； 72℃延伸10min.反应体系见表2： 表2PCR反应体系(50uL) 试剂 体积(uL) Premix 25 U3(10uM) 1 L3(10uM) 1 cDNA模板 6 ddH20 17 10- ...
农业农村部公告第717号-2-2023 鸡传染性法氏囊病活疫苗中非法添加改变制苗用毒种检测方法.pdf
