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中华人民共和国农业行业标准
Protocol of purity identification for soybean varietyusing-SSRmolecularmarkers
中华人民共和国农业部发布
前言
本标准的附录A.附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国农业部提出并归口.本标准负责起草单位：全国农业技术推广服务中心、中国农业科学院作物科学研究所.
本标准主要起草人：廖琴、陈应志、邱丽娟、常汝镇、关荣霞、李春广、王爱珺.
大豆品种纯度鉴定技术规程SSR分子标记法
1范围
本标准规定了大豆品种纯度的SSR分子标记检测技术规程，本标准适用于大豆品种纯度签定.
2原理
简单重复序列（SSR）分布于大豆整个基因组的不同位置上，不同品种每个位点上重复单位的数目及序列可能不同，因而形成片段长度多态性.由于每个简单重复序列两端的序列是高度保守的单拷贝序列，因面可根据其两端的序列设计一对特异引物，利用PCR技术对重复序列进行扩增，扩增产物通过 电泳进行分离，经硝酸银染色，可辨别SSR电泳谱带，通过选用品种间其有广泛多态性的SSR引物，根据PCR扩增产物电泳谱带差异（等位变异数目），鉴定大豆品种纯度.
3仪器设备、试剂与耗材
参见附录A.
4试剂配制
4.1DNA提取试剂
4.1.10.5mol/L乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）（pH8.0）溶液
称取EDTA186.1g，倒人1000mL烧杯中，加800mL.去离子水溶解，用固体氢氧化钠调pH至8.0，再加去离子水定容至1000mL，混匀，过滤.在4℃条件下保存.
称取Tris 60.55g，倒入500mL.烧杯中，加400mL去离子水溶解，用HCI调pH至8.0，再加去离子水定容至500mL，混匀，4C条件下保存.
4.1.3DNA提取液
称取氯化钠（NaCl)14.6g，倒人500mL烧杯中，加100mL去离子水溶解，加1mol/LTris-HCI溶液50mL，加0.5mol/1.EDTA溶液50mL和SDS10g，用去离子水定容至500mL，60C水溶解，混匀.4℃条件下保存.
4.1.4三氯甲烷/异戊醇（241）
取240mL三氯甲烷和10mL异戊醇，混匀.
4.2PCR扩增试剂
4.2.1四种脱氧核糖核苷酸（dNTPs：dATP、dCTP、dGTP、dTTP）混合溶液配制
取浓度为100mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP储存液各20μL混合，加人920μL超纯水，配成终浓度为2mmol/L工作液.一20C条件下保存.
4.2.2引物稀释
用超纯水分别配制正向（F)引物和反向（R）引物至浓度均为100μmol/L.的储存液，取10gL储存液加人490μL超纯水配成2μmol/L工作液.
4.3变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂
4.3.110×TBE缓冲液
NY/T 1788-2009
分别称取Tris108g，硼酸55g，倒人1000mL烧杯中，加人800mL去离子水加热溶解，再加入0.5mol/LEDTA溶液37mL，混匀，定容至1000mL.
4.3.26%（W/V）变性聚丙烯酰胺凝胶
入50mL10×TBE，加人420.42g豚.用去离子水定容至1000mL，混匀，过滤.4C条件下保存. 分别称取丙烯酰胺57g和甲叉双丙烯酰胺3g，倒人1000mL烧杯中，加入600mL去离子水，再加
4.3.3疏水硅烷工作液
取4mL疏水硅烷原液加入96mL三氯甲烷中，混匀，配制成4%工作液.
4.3.410%（W/V）过硫酸铵（APS）
称取过硫酸铵0.1g，加人1mL去离子水，混匀.4C条件下保存（保存期7d）.
取10XTBE缓冲液500mL，加去离子水4500mL，混匀.
4.3.66×加样缓冲液
称取澳酚兰和二甲苯青各0.125g，分别加入甲酰胺49mL和0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1mL，混匀，备用.
4.3.7硫代硫酸钠溶液（10mg/mL）
取1g硫代硫酸钠，加人100mL超纯水溶解.
4.4银染、显影试剂
4.4.1固定液（10%冰醋酸）取冰醋酸100mL，加去离子水900mL，混匀.4.4.2染色液（0.1%硝酸银） 称取硝酸银1g.加去离子水1000mL溶解，加1.5mL甲醛溶液（37%），混匀，
4.4.3显影液（3%无水碳酸钠）
称取无水碳酸钠30g，加1000mL去离子水溶解，再加甲醛1.5mL和200gL硫代硫酸钠溶液（10mg/mL)，混匀
5引物（见资料性附录B）
6操作步骤
6.1试样制备
每个品种取50粒种子，每粒种子反胚方向取等量组织混合制样.
6.1.2杂交种
每个品种取50粒种子，单粒制样.
6.2DNA提取
从制样中取50mg豆粉放人2mL离心管中，加700pL预热（60C）的DNA提取液，60C水浴1h，每隔15分钟频倒混匀一次，再加700gL苯酚/三氯甲烷（1：1），轻轻混匀，室温静置30min，10000g离心10min.将上清液转移到一新的1.5mL离心管中，加等体积苯酚/三氯甲烷（1：1).轻轻混匀，室温静置10min，10000g离心10min.将上清液转移到一新的1.5mL离心管中，加人2倍体积无水乙醇，在450pL超纯水中，加3pLRNA酶（10mg/mL），37C水浴30min，加等体积三氯甲烷/异成醇（24 轻轻瓣倒混匀，10000g离心10min，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两次，风干残余乙醇，将沉淀溶解1)，混匀，静置10min，10000g离心10min.将上清液转移至一新的1.5mL离心管中，加2倍体积的无水乙醇，献倒混匀，10000g离心10min，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀两次，风干残余乙醇，将沉淀
NY/T 1788-2009
溶解在200uL超纯水中.用紫外分光光度计检测DNA浓度，将DNA稀释到20ng/pl.-20C条件下保存.
6.3PCR反应体系及程序
引物，1UTaqDNA聚合酶，40ng被测样品DNA，加双蒸水补足20L. PCR反应体系含1×的 PCR缓冲液，150cmol/L dNTPs，150pmol/L正向引物、150pmol/L反向
PCR反应程序为94℃C预变性5min；94℃变性30s，47C退火30s 72C延伸30s，运行35个循环；72℃延伸5min.4℃条件下保存.
6.4变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
6.4.1玻璃板处理
水乙醇，4uL冰醋酸，4pL亲和硅烷原液，摇匀，均匀涂在无凹槽玻璃板上.在通风橱中用0.5mL疏水硅烷工作液均匀涂布凹槽玻璃板，操作过程中两块玻璃板分别处理，防止互相污染，
6.4.2玻璃板组装
平仪检测玻璃胶室是否水平. 待玻璃板彻底干燥后，将塑料隔条整齐放在无凹槽玻璃板两侧，盖上凹槽玻璃板，夹子固定后，用水
6.4.3灌胶
取6%的丙稀酰胺胶50mL 加人50LTEMED和200gL10%APS溶液.轻轻摇匀，将胶缓缓灌人玻璃胶室，待胶室灌满后，在凹槽处将鲨鱼齿朝外轻轻插入样品梳，在室温下聚合1h以上.
6.4.4预电泳
1×TBE缓冲液，用吸管吸1×TBE彻底冲洗凹糖胶面，100W恒功率预电泳20min，使凝胶预热. 拔出样品梳，冲洗凹槽处残余的胶，将玻璃板与电泳槽组装，在正极槽（下槽）和负极槽（上槽）加入
6.4.5PCR扩增产物变性处理
PCR产物中加5xL6×加样缓冲液，混匀后，95C水浴变性5min，立即置冰水中冷却.
6.4.6电泳
100W恒功率电泳，使凝胶温度保持在55℃左右（温度过高容易使玻璃板炸裂），至指示剂（二甲苯青）接近胶板的底部时，结束电泳.
6.5染色
6.5.1圈定
摇匀15min.取出胶板，放在水洗槽中，加入1000mL蒸馏水，在摇床上摇10min， 电泳结束后，分开两块玻璃板，将附着凝胶的玻璃板浸人10%冰醋酸固定液中，在摇床上30r/min
6.5.2染色
从水洗槽中取出胶板，放人0.1%AgNO，染色液中，在摇床上30r/min摇染20min.取出胶板，用蒸馏水快速漂洗（时间不超过10s）.
6.5.3显像
酸固定液中，定影5min.用蒸罐水漂洗胶板5min，取出晾干.将玻璃板放在观片灯上，记录结果，拍照保存.
7统计与计算
7.1常规品种
