SC
中华人民共和国水产行业标准
生金枪鱼肉种类鉴定方法 实时荧光PCR法
Identification ofraw tuna meat species-Real-time PCRmethod
中华人民共和国农业农村部 发布
前言
本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的责任.
本文件由农业农村部渔业渔政管理局提出.
生金枪鱼肉种类鉴定方法实时荧光PCR法
1范围
本文件描述了用实时荧光PCR法测定生金枪鱼肉种类的原理、试剂和材料、仪器设备、样品制备、DNA提取、DNA纯度和浓度测定、测定方法、质量控制与结果判定、防污染措施.
本文件适用于生金枪鱼肉产品种类的定性检测.包括马苏金枪鱼（Thamnus maccoyii）、大目金枪鱼（Tharmms obesas）、长鳍金枪鱼（Thmnas alalanga）、蓝鳍金枪鱼（Thzrmax thyanas）、黄鳍金枪鱼（Thuanasalbacares）的生鱼肉产品.本文件不适用于混合样品.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.4转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义
GB/T19495.4界定的下列术语和定义适用于本文件.
3. 1
实时荧光PCR real-time polymerase chain reaction
实时荧光聚合酶链式反应.在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，并通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.
3. 2
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阅值时所经历的循环数.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件.BSA;牛血清蛋白(bull serum albumin)CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammonium bromide)Ct:循环阔值(cycle threshold)DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid） DNase：脱氧核糖核酸酶（deoxyribonuclease)dATP:脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosine triphosphate)dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate)dGTP:脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate)dNTPs：脱氧核甘酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） d’TTP：脱氧胸甘三磷酸（deoxythymidine triphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetie acid)FAM，双基荧光素（carboxy fluorescein）IU;酶活国际单位（International Unit)
MGB：小沟结合物（minor groove binder)PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）RNA：核糖核酸（ribonucleic acid) RNase H:核糖核酸酶 H(ribonuclease H)ROX：羧基-X-罗丹明（carboxy-X-rhodamine)SNP：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism）Tag：水生桥热菌（Thermus aqaticu）Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl)aminomethane] Tris-base:（三（羟甲基）氨基甲烷-碱）TritonX-100：（聚乙二醇辛基苯基醚）18S rRNA ; 18S 核糖体 RNA(18S ribosomal RNA)
5原理
针对金枪鱼物种特异性SNP位点设计引物与探针，通过分析实时荧光PCR扩增曲线与Ct值，对生金枪鱼肉的种类进行定性判定.
6试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水为GB/T6682中规定的一级水；所用试剂、材料均应不含DNA 和 DNase.
6.1试剂6.1.1苯酚.6.1.2浓盐酸.6.1.4异戊醇. 6.1.3氯仿.6.1.5异丙醇.6.1.6无水乙醇.6.1.7 CTAB.6.1.8氯化钠.6. 1.9 Tris-base 6. 1. 10 Na EDTA.6.1.11蛋白酶K：40 IU/mg.6.1.12热启动Tag DNA聚合酶；5 IU/μl.6. 1. 13 RNase H;5 IU/gl6.1.14氯化钾.6.1.15硫酸铵. 6.1.16七水硫酸镁.6. 1. 17Triton X-100.6.1.18 BSA.6. 1. 19 dNTPs.6. 1.20 dATP.6. 1.21 dCTP.6.1.22 dGTP. 6.1.23 dTTP.2
