中华人民共和国国家标准
GB 15193.13-2015
食品安全国家标准 90天经口毒性试验
中华人民共和国 国家卫生和计划生育委员会 发布
前言
本标准代替GB15193.13-2003（30天和90天喂养试验》.本标准与GB15193.13-2003相比，主要变化如下： 标准名称修改为食品安全国家标准90天经口毒性试验”：修改了“范围”；一增加了“仪器与试剂"项目； 修改了“原理”；增加了“试验方法"项目；一增加了受试物处理要求；修改了“实验动物”；修改了“操作步骤”； 修改了“剂量与分组”；修改了给予受试物的方式：修改了观察指标；增加了体重和摄食及饮水消耗量、眼部检查、尿液检查、体温、心电图检查内容：修改了“数据处理”； 修改了血液学检查、血生化检查、病理检查指标：增加了结果评价内容；增加了“试验报告”项目：一增加了“结果解释”项目.
食品安全国家标准 90天经口毒性试验
1范围
本标准规定了实验动物90天经口毒性试验的基本试验方法和技术要求.本标准适用于评价受试物的亚慢性毒性作用.
2术语和定义
2.1亚慢性毒性
实验动物在不超过其寿命期限10%的时间内（大鼠通常为90d），重复经口接触受试物后引起的健康损害效应.
2.2未观察到有害作用剂量
通过动物试验，以现有的技术手段和检测指标未观察到任何与受试物有关的毒性作用的最大剂量.
2.3最小观察到有害作用剂量
在规定的条件下，受试物引起实验动物组织形态、功能、生长发育等有害效应的最小作用剂量.
2.4靶器官
实验动物出现由受试物引起明显毒性作用的器官.
2.5卫星组
在毒性研究设计和实施中外加的动物组，其处理和饲养条件与主要研究的动物相似，用于试验中期或试验结束恢复期观察和检测，也可用于不包括在主要研究内的其他指标及参数的观察和检测.
3试验目的和原理
确定在90d内经口重复接触受试物引起的毒性效应，了解受试物剂量-反应关系、毒作用靶器官和确定受试物的经口安全性，并为慢性毒性试验剂量、观察指标、毒性终点的选择以及获得“暂定的人体健 可逆性，得出90d经口最小观察到有害作用剂量（LOAEL）和未观察到有害作用剂量（NOAEL），初步康指导值"提供依据.
4仪器和试剂
4.1仪器/器械
实验室常用解剖器械、电子天平、生物显微镜、检眼镜、血生化分析仪、血液分析仪、凝血分析仅、尿液分析仪、心电图扫描仪、离心机、病理切片机等.
4.2试剂
分析试剂（或试纸）等. 甲醛、二甲苯、乙醇、苏木素、伊红、石蜡、血球分析仪稀释剂、血生化分析试剂、凝血分析试剂、尿液
5试验方法
5.1变试物
受试物掺人何料、饮用水或滥胃给予. 受试物应使用原始样品，若不能使用原始样品，应按照受试物处理原则对受试物进行适当处理.将
5.2实验动物
5.2.1动物选择
实验动物的选择应符合GB14922.1和GB14922.2的有关规定.选择已有资料证明对受试物敏感的动物物种和品系，一般啮齿类动物首选大鼠，非晒齿类动物首选犬（通常选用Beagle犬），大鼠周龄推荐不超过6周，体重50g~100g.试验开始时每个性别动物体重差异不应超过平均体重的土20%， 每组动物数不少于20只，雌雄各半；若计划试验中期观察或试验结束做恢复期的观察，应增加动物数（对照和高剂量增加卫星组，每组10只，雌雄各半）.大通常选用4个月～6个月的幼犬，一般不超过9个月，试验开始时每个性别动物体重差异不应超过平均体重的土20%，每组动物数不少于8只，雌雄各半：若计划试验中间户检或试验结束做恢复期的观察，应增加动物数（对照和高剂量增加卫星组，每组 4只，雌雄各半）.对照组动物性别和数量应与受试物组相同.
5.2.2动物准备
试验前大鼠在实验动物房至少应进行3d~5d（犬7d~14d）环境适应和检疫观察.
5.2.3动物饲养
实验动物饲养条件应符合GB14925、饮用水应符合GB5749、饲料应符合GB14924的有关规定.试验期间动物自由饮水和摄食，动物推荐单笼饲养，大鼠也可按组分性别分笼群何，每笼动物数（一般不超过3只）应满足实验动物最低需要的空间，以不影响动物自由活动和观察动物的体征为宜.试验期间 每组动物非试验因素死亡率应小于10%，濒死动物应尽可能进行血液生化指标检测、大体解剖以及病理组织学检查，每组生物标本损失率应小于10%.
5.3剂量
5.3.1分组
要观察血液生化指标、户检或试验结束做恢复期观察，对照和高剂量需增设卫星组，对照组除不给受试 试验至少设3个受试物剂量组，1个阴性（溶媒）对照组，必要时增设未处理对照组.若试验中期需物外，其余处理均同受试物剂量组.
5.3.2剂量设计
5.3.2.1原则上高剂量应使部分动物出现比较明显的毒性反应但不引起死亡；低剂量不宜出现任何观 察到毒效应（相当于NOAEL），且高于人的实际接触水平：中剂量介于两者之间，可出现轻度的毒性效应，以得出NOAEL和（或)LOAEL.一般递减剂量的组间距以2倍～4倍为宜，如受试物剂量总跨度
过大可加设剂量组.试验剂量的设计参考急性毒性LD剂量、28天经口毒性试验剂量和人体推荐摄人量进行.
5.3.2.2能求出LD的受试物，以28天经口毒性试验的NOAEL或LOAEL作为90天经口毒性试验的最高剂量组：或以LD的5%～15%作为最高剂量组，此LD百分比的选择主要参考LD剂量反应 曲线的斜率，然后在此剂量下设几个剂量组最低剂量组至少是人体推荐摄人量的3倍.
5.3.2.3求不出LD的受试物，试验剂量应尽可能涵盖人体预期摄入量100倍的剂量，在不影响动物摄食及营养平衡前提下应尽量提高高剂量组的剂量，对于人体推荐摄入量较大的受试物，高剂量组亦可以按最大给予量设计.
5.4试验步骤和观察指标
5.4.1受试物给予
5.4.1.1根据受试物的特性或试验目的，选择受试物掺人何料、饮水或灌胃方式给予，若受试物影响动物适口性，应灌胃给予.受试物应连续给予90d.
5.4.1.2受试物灌胃给予，要将受试物溶解或悬浮于合适的溶媒中，首选溶媒为水、不溶于水的受试物可使用植物油（如橄榄油、玉米油等），不溶于水或油的受试物亦可使用羧甲基纤维素、淀粉等配成混悬液或榈状物等.受试物应新鲜配制，有资料表明其溶液或混悬液储存稳定者除外.为保证受试物在动 物体内浓度的稳定性，每日同一时段灌胃1次（每周灌胃6d）.试验期间，前4周每周称体重2次，之后每周称体重1次，按体重调整灌胃体积.灌胃体积一般不超过10mL/kg体重，如为水溶液时，最大灌胃体积大鼠可达20mL/kg体重，犬为15mL/kg体重；如为油性液体，滥胃体积应不超过4mL/kg体重；各组滥胃体积一致.
5.4.1.3受试物掺入饲料或饮水给予，要将受试物与饲料（或饮水）充分混匀并保证该受试物配制的稳定性和均一性，以不影响动物摄食、营养平衡和饮水量为原则，受试物掺人饲料比例一般小于质量分数5%，若超过5%时（最大不应超过10%），可调整对照组饲料营养素水平（若受试物无热量或营养成分，且添加比例大于5%时，对照组何料应填充甲基纤维素等，掺人量等同高剂量），使其与剂量组饲料营养素水平保持一致，同时增设未处理对照组；亦可视受试物热量或营养成分的状况调整剂量组何料营养素 水平，使其与对照组饲料营养素水平保持一致.受试物剂量单位是每千克体重所摄人受试物的毫克（或克）数，即mg/kg体重（或g/kg体重），当受试物掺人饲料其剂量单位亦可表示为mg/kg（或g/kg）何料，掺人饮水则表示为mg/mL水，受试物掺人饲料时，需将受试物剂量（mg/kg体重）按动物每100g体重的摄食量折算为受试物饲料浓度（mg/kg饲料），一般90天经口毒性试验大鼠每日摄食量按体重8%折算.
5.4.2一般临床观察
观察期限为90d，若设恢复期观察，动物应停止给予受试物后继续观察28d，以观察受试物毒性的可逆性、持续性和迟发效应.试验期间至少每天观察一次动物的一般临床表现，并记录动物出现中毒的体征、程度和持续时间及死亡情况.观察内容包括被毛、皮肤、眼、黏膜、分泌物、排泄物、呼吸系统、神经 系统、自主活动（如：流泪、竖毛反应、瞳孔大小、异常呼吸）及行为表现（如：步态、姿势、对处理的反应、有无强直性或阵李性活动、刻板反应、反常行为等）.对体质弱的动物应隔离，濒死和死亡动物应及时解剖.
5.4.3体重和摄食及饮水消耗量
每周记录体重、摄食量，计算食物利用率：试验结束时，计算动物体重增长量、总摄食量、总食物利用率.受试物经饮水给予，应每日记录饮水量.如受试物经掺人何料或饮水给予，应计算和报告受试物各
