中华人民共和国国家标准
GB 4789.12-2016
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB/T4789.12-2003《食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验》.本标准与GB/T4789.12-2003相比，主要变化如下： 标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验”：一增加了PCR鉴定方法；增加了结果与报告：一修改了设备和材料； 增加了附录A；修改了培养基和试剂；修改了检验程序；规范了样品制备过程；修改了操作步骤中增菌和分离培养部分试验方法.
食品安全国家标准
食品微生物学检验 肉毒梭菌及肉毒毒素检验
1范围
本标准规定了食品中肉毒梭菌（Clostridinmr botlinam）及肉毒毒素（botulinum toxin）的检验方法，
本标准适用于食品中肉毒梭菌及肉毒毒素的检验.
2设备和材料
2.1冰箱：2℃~5C、-20℃. 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.2天平：感量0.1g.2.3无菌手术剪、镊子、试剂勺.2.5离心机：3 000 r/min 14 000 r/min 2.4均质器或无菌乳体.2.6厌氧培养装置.2.7恒温培养箱：35C士1℃、28℃土1℃2.8恒温水浴箱：37℃±1℃、60℃±1℃、80℃士1℃.2.9显微镜：10倍~100倍.2.10 PCR仪. 2.11电泳仪或毛细管电泳仪，2.12凝胶成像系统或紫外检测仪，2.13核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.2.15无菌吸管：1.0mL、10.0mL、25.0mL.2.16无菌锥形瓶：100ml.2.17培养Ⅲ：直径90mm.2.18离心管：50mL、1.5ml2.20无菌注射器：1.0ml. 2.19PCR反应管.2.21小鼠：15g~20g，每一批次试验应使用同一品系的KM或ICR小鼠.
3培养基和试剂
除另有规定外，PCR试验所用试剂为分析纯或符合生化试剂标准，水应符合GB/T6682中一级水的要求.
3.1应肉培养基：见A.1.3.2胰蛋白酶胰蛋白陈葡萄糖酵母膏肉汤（TPGYT）：见A.2.3.3卵黄琼脂培养基：见A.3.3.4明胶磷酸盐缓冲液：见A.4.3.5革兰氏染色液：见A.5.3.610%胰蛋白酶溶液：见A.6 3.7磷酸盐缓冲液（PBS）：见A.7.3.81mol/L氢氧化钠溶液.3.91mol/L盐酸溶液.3.10肉毒毒素诊断血清.3.11无水乙醇和95%乙醇.3.1210mg/mL溶菌酶溶液.3.13 310mg/mL蛋白酶K溶液.3.143 mol/L乙酸钠溶液(pH5.2).3.15 TE缓冲液.3.16引物：根据表1中序列合成临用时用超纯水配制引物浓度为10μmol/L. 3.17 10XPCR缓冲液.3.18 325 mmol/L MgCl.3.19 9dNTPs:dATP dTTP dCTP dGTP.3.20 “b3.21 1琼脂糖：电泳级.3.22 2澳化乙锭或Goldview.3.235XTBE缓冲液.3.246×加样缓冲液.3.25DNA分子量标准.
4检验程序
肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序见图1.
图1肉毒梭菌及肉毒毒素检验程序
5操作步骤
5.1样品制备
5.1.1样品保存
待检样品应放置2℃C~5℃冰箱冷藏.
5.1.2固态与半固态食品
固体或游离液体很少的半固态食品，以无菌操作称取样品25g，放人无菌均质袋或无菌乳体，块状食品以无菌操作切碎，含水量较高的固态食品加人25mL明胶磷酸盐缓冲液，乳粉、牛肉干等含水量低
