中华人民共和国国家标准
GB 4789.36-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会 国家食品药品监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB/T4789.36-2008《食品卫生微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验》.本标准与GB/T4789.36-2008相比，主要变化如下：标准名称修改为“食品安全国家标准食品微生物学检验大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验”：修改了标准的范围：一修改了培养基和生化反应的文字描述； 修改了设备和材料：剩除“第二法免疫磁珠捕获法的原理”；删除“第三法全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法”：一删除“第四法全自动病原菌检测系统筛选法”.
食品安全国家标准
大肠埃希氏菌O157：H7/NM检验 食品微生物学检验
1范圈
本标准规定了食品中大肠埃希氏菌O157：H7/NM（Escherichia coli O157：H7/NM）的检验方法.本标准适用于食品中大肠埃希氏菌O157：H7/NM的检验.
2设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1恒温培养箱：36℃土1℃2.2冰箱：2C~5℃.2.3恒温水浴箱：46℃土1℃.2.4天平：感量0.1g、0.01g. 2.5均质器.2.6显微镜：10倍~100倍.2.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10 mL（具0.1mL刻度）或移液器及吸头.2.8无菌均质杯或无菌均质袋：容量500ml.2.9无菌培养Ⅲ：直径90mm. 2.10pH计或精密pH试纸.2.11长波紫外光灯：365nm，功率≤6W.2.12微量离心管：1.5mL或2.0mL.2.13磁板、磁板架、样品混合器.2.14微生物鉴定系统.
3培养基和试剂
3.1改良EC肉汤（mECn）：见A.1.3.3三糖铁琼脂（TSI）：见A.3. 3.2改良山梨醇麦康凯琼脂（CT-SMAC）：见A.2.3.4营养琼脂：见A.4.3.5半固体琼脂：见A.5.3.6月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-MUG（MUG-LST）：见A.6. 3.7氧化酶试剂：见A.7.3.8革兰氏染色液：见A.8.3.9PBS-Tween 20 洗液：见 A.9.3.10亚确酸钾（AR级）.
3.11头孢克（Cefixime）.3.12大肠埃希氏菌0157显色培养基. 3.13大肠埃希氏菌O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂.3.14鉴定试剂盒.3.15抗-E.coliO157免疫磁珠.
第一法常规培养法
4检验程序
大肠埃希氏菌O157：H7/NM常规培养法检验程序见图1.
图1大肠埃希氏菌0157：H7/NM常规培养法检验程序
5操作步骤
5.1增菌
器上连续均质1min~2min；或放人盛有225mLmECn肉汤的均质杯中.8000r/min~ 以无菌操作取检样25g（或25mL）加人到含有225mLmECn肉汤的均质袋中，在拍击式均质10 000r/min均质 1 min~2min.36℃±1C培养18 h~24 h.
5.2分离
取增菌后的mEC十n肉汤，划线接种于CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上，36C土1C培养18h~24h.观察菌落形态.在CT-SMAC平板上，典型菌落为圆形、光滑、较小的无色菌落，中心呈现较暗的灰褐色；在大肠埃希氏菌0157显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行判定，
5.3初步生化试验
在CT-SMAC和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上分别挑取5个~10个可疑菌落，分别接种TSI琼脂，同时接种MUG-LST肉汤，并用大肠埃希氏菌株（ATCC25922或等效标准菌株）做阳性对照和大肠埃希氏菌O157：H7（NCTC12900或等效标准菌株）做阴性对照，于36℃士1C培养18h~24h.必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色.在TSI琼脂中，典型菌株为斜面与底层均呈黄色，产气或 不产气，不产生硫化氢（HS）.置MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察，MUG阳性的大肠埃希氏菌株应有荧光产生，MUG阴性的应无荧光产生，大肠埃希氏菌O157：H7/NM为MUG试验阴性，无荧光.挑取可疑菌落，在营养琼脂平板上分纯，于36℃土1C培养18h~24h，并进行下列鉴定.
5.4鉴定
5.4.1血清学试验
验.对于H7因子血清不凝集者，应穿刺接种半固体琼脂，检查动力，经连续传代3次，动力试验均阴 在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落用O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试性，确定为无动力株，如使用不同公司生产的诊断血清或乳胶凝集试剂，应按照产品说明书进行.
5.4.2生化试验
5.4.2.1自营养琼脂平板上挑取菌落，进行生化试验.大肠埃希氏菌O157：H7/NM生化反应特征见表1.
表1大肠埃希民菌O157：H7/NM生化反应特征
生化试验 特征反应三糖铁琼脂 底层及斜面呈黄色.HS阴性山梨醇 阴性或迟缓发酵靛基质 甲基红-伏普试验（MR-VP) 阳性 MR 阳性 VP 阴性氧化酶 阴性西蒙氏柠橡酸垫 阴性赖氨酸脱线酶 阳性（紫色）乌氨酸脱酸酶 阳性（紫色）纤维二糖发酵 阴性 阳性MUG 试验 棉子糖发酵 阴性（无荧光）动力试验 有动力或无动力
