中华人民共和国国家标准
GB 5009.86-2025
食品安全国家标准
食品中抗坏血酸的测定
中华人民共和国国家卫生健康委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准代替GB5413.18-2010（婴幼儿食品和乳品中维生素C的测定）和GB5009.86-2016（食品中抗坏血酸的测定》.
本标准与GB5009.86-2016相比，主要变化如下： 一扩大了液相色谱法和荧光分光光度法的适用范围；修改了液相色谱法和荧光分光光度法检出限、定量限和标准曲线浓度范围；优化了液相色谱法的色谱条件.
食品安全国家标准
食品中抗坏血酸的测定
1范围
本标准规定了食品中抗坏血酸的测定方法.第一法液相色谱法适用于食品中L-抗坏血酸、D-异抗坏血酸的测定.第二法荧光分光光度法适用于特殊膳食用食品、乳及乳制品、水果和蔬菜及其制品中抗坏血酸的测定，以及未添加D-异抗坏血酸的上述食品中L-抗坏血酸的测定.
第三法2.6-二氯靛酚滴定法适用于水果和蔬菜及其制品中还原型抗坏血酸的测定.
第一法液相色谱法
2原理
试样中的抗坏血酸经提取、还原和稀释后，以含有离子对试剂和还原剂的混合溶液作为流动相，经反相色谱分离，紫外检测器或二极管阵列检测器检测，以色谱峰的保留时间定性，外标法定量.
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
3.1试剂
3.1.1冰乙酸（CHO）.3.1.2三氯乙酸（CHCIO，TCA）.3.1.3偏磷酸（HPO）.3.1.440%四丁基氢氧化铵水溶液（40%TBAH）.3.1.5乙酸铵（CH，NO）.3.1.7三(2-羧乙基）麟（C，HOP，TCEP）. 3.1.6L-半胱氨酸（CHNOS）.3.1.8乙晴（CHN)：色谱纯.
3.2试剂配制
3.2.1乙酸铵溶液（500mmol/L pH5.4）：称取乙酸铵19.27g，加水溶解并稀释至500mL，用冰乙酸调pH至5.4.3.2.2TCA溶液（150g/L)：称取TCA75g，加水溶解并稀释至500mL，混匀.3.2.3偏磷酸溶液（200g/L）：称取偏磷酸100g，加水溶解并稀释至500mL，混匀.3.2.4TCEP溶液（250 mg/L):称取TCEP125mg，加水溶解并稀释至500mL，混匀.3.2.5L-半胱氨酸溶液（40g/L）：称取L-半胱氨酸40g，加适量水超声溶解，再加水稀释至1L，混匀.
临用现配.
3.2.6流动相：量取水900mL于烧杯中，吸取40%TBAH溶液3.25mL、称取乙酸铵3.85g置于水中，然后加人TCEP50mg（或L-半胱氨酸溶液20mL），再加入乙晴10mL，混匀后用冰乙酸（约3.14mL）调pH至4.5~5.0；最后加水稀释至1L，混匀；超声除去气泡.
3.3标准品
3.3.1L-抗坏血酸标准品（C HO，CAS号：50-81-7）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品.3.3.2D-异抗坏血酸标准品（CHO，CAS号：89-65-6）：纯度≥99%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品.
3.4标准溶液配制
3.4.1L-抗坏血酸标准溶液（50μg/mL)：称取L-抗坏血酸标准品10mg（精确至0.1mg），用TCEP溶液溶解并定容至10mL，混匀.准确吸取上述标准溶液500gL于10mL棕色容量瓶中，用TCEP溶液3.4.2D-异抗坏血酸标准溶液（50μg/mL）：称取D-异抗坏血酸标准品10mg（精确至0.1mg），用 定容，混匀，将溶液转移至棕色玻璃容器中，临用现配，TCEP溶液溶解并定容至10mL.混匀.准确吸取上述标准溶液500L于10mL棕色容量瓶中，用TCEP溶液定容，混匀.将溶液转移至棕色玻璃容器中，临用现配.3.4.3L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸标准系列工作液：分别准确吸取L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸标准 溶液(50pμg/mL)10pL、100μL、200μL、400μL、1 000μL和 2 000μL于10 mL 棕色容量瓶中 用流动相定容，轻摇混匀.L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸标准系列工作液的质量浓度分别为0.05pg/mL、0 50 μg/mL、1.0 μg/mL 、2.0 μg/mL、5.0 μg/mL 和 10 μg/mL 临用现配
注：可依据实际待测样品情况，在线性范围内适当调整标准落液浓度范围.
4仅器和设备
4.1液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器.4.2天平：感量分别为0.01 mg和0.1 mg. 4.3pH计：精度为0.1.4.4涡旋混合器：转速不低于1500r/min.4.5离心机：转速不低于5000r/min.4.6超声波清洗仪，
5分析步骤
5.1试样制备
液体样品和浆体样品摇匀；半固态样品和粉状样品混匀；胶基糖果等胶状样品需剪刀剪碎或冷冻状态粉碎混匀；其他样品需匀浆或粉碎混匀.水果和蔬菜及其制品（取可食部分）需10：1加人150g/L的TCA溶液或200g/L的偏磷酸溶液匀浆或粉碎均匀.
注：处理过程应尽可能在避光条件下进行：样品制备后立即进行下一步试验.
5.1.1试样称取
5.1.1.1固体（含半固体）样品
称取制备后的试样25g（精确至0.001g）于锥形瓶中，加人TCEP溶液225g（精确至0.001g），充分溶解混匀.称取混匀后的溶液2g（精确至0.001g）于10mL容量瓶中.
5.1.1.2液体（含浆体）样品
称取制备后的试样2g（精确至0.001g）或准确吸取2mL于10mL容量瓶中.
5.1.2试样提取与还原
匀，静置反应5min，用水定容，混匀.然后转移至离心管，5000r/min离心1min，此样液为还原样液. 于上述10mL容量瓶中，加人TCEP溶液（或L-半胱氨酸溶液）4mL，再加人TCA溶液2mL混注：氨基酸配方粉、蛋白水解配方粉、部分蛋白水解配方粉等特殊医学用途配方食品和羊乳粉应使用L-半胱氨酸作为还原剂.
5.1.3试样稀释
吸取离心后的上清液1mL于10mL容量瓶中，加乙酸铵溶液1mL，用流动相定容，混匀，此样液为稀释样液，取适量过0.22um水系微孔滤膜至棕色进样瓶中，供液相色谱测定.
注：必要时.可改变稀释倍数确保待测液中抗坏血酸浓度在线性范围内.
5.2仪器参考条件
5.2.1色谱柱：C柱（柱长150mm，内径4.6mm，填料粒径4μm）或性能相当的色谱柱.5.2.2柱温：室温.5.2.4流速;1.0 mL/min. 5.2.3流动相：按照3.2.6配制.5.2.5检测波长：265nm.5.2.6进样量：10pL.
5.3标准曲线的制作
将标准系列工作液分别注入液相色谱仅中，得到相应的峰面积，以标准系列工作液中L抗坏血酸或D-异抗坏血酸的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线.L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸标准溶液的色谱图参见附录A中图A.1.
5.4试样溶液的测定
将试样溶液注入液相色谱仪中，得到抗坏血酸的峰面积，根据标准曲线得到待测液中抗坏血酸的浓度.
6分析结果的表述
试样中L-抗坏血酸或D-异抗坏血酸的含量按公式（1）计算：
