NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T2679-2015
甘蔗病原菌检测规程 宿根矮化病菌环介导等温扩增检测法
Detection procedures of sugarcane pathogen--Leifsonia xyli subsp.xyliDetectionmethod of loop-mediated isothermal amplification
中华人民共和国农业部发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由农业部种植业管理司提出.本标准由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC510）归口.本标准起草单位：福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室、农业部甘蔗及制品质量监督检验测试中心. 本标准主要起草人：许莉萍、阀友雄、郭晋隆、吴期滨、陈如凯、周定港、罗俊、陶玲.
甘蔗病原菌检测规程宿根矮化病菌环介导等温扩增检测法
1范围
本标准规定了环介导等温扩增技术检测甘蔗宿根矮化病菌（Leifsomiazylisubsp.xyli)的原理、试剂和材料、仪器和设备、操作步骤、结果判定与表述等技术内容.
本标准适用于甘蔗组培苗、田间植株、种苗、种茎中甘蔗宿根矮化病菌的LAMP检测.
2缩略语和将号
2.1下列缩略语适用于本标准
2.1. 1LAMP：loop-mediated isothermal armplification，环介导等温扩增.2.1.2dNTPsMixturedeoxyribonucleosidetriphosphates mixture，脱氧核苷三确酸混合液.2.1.3ddHO:double distilledHO.双蒸水.2.1.4CTABhexadccyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化镀. 2.1.5Tris:ris（hydroxymethyl）methyl aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷，2.1.6EDTA，Edetatedisodium，乙二胺四乙酸钠.2.1.7LF：forward loop primer，正向环引物.2.1.8LB：backward loop primer，反向环引物.
2.2下列符号适用于本标准
2.2.1F3c在靶基因的3末端设定的一个区段.2.2.2F2c：在靶基因的3'末端设定的一个区段，位于F3c的5'端.2.2.3F1c：在靶基因的3末端设定的一个区段，位于F2c的5'端. 2.2.4B1：在靶基因的5末端设定的一个区段.2.2.5B2：在靶基因的5'末端设定的一个区段，位于B1的5'端.2.2.6B3：在靶基因的5'末端设定的一个区段，位于B2的5'端.2.2.7F3（forwardouterprimer）：正向外引物，含有与目标DNA上的F3c序列互补的区段.2.2.8B3（backwardouterprimer）：反向外引物，含有与目标DNA上的B3相同序列的区段.2.2.9FIP（forward inner primmer）：正向内引物，在3末端含有与F2c互补的F2区段，在5'末端含有2.2.10BIP（backwardinnerprimer）：反向内引物，在3末端含有与B2c互补的B2区段，在5'末端含 与F1c相同序列的区段.有与Ble相同序列的区段.
3原理
DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离成为单链，在靶基因的3'末端设定F3c、 LAMP是一种恒温核酸扩增方法.DNA在65C左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链F2c、F1e3个区段，在5末端设定B1、B2、B33个区段.针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用链置换DNA聚合酶在等温（65C左右）条件下保温一定的时间，即可完成核酸扩增反应.以感染了甘燕宿根矮化病菌（Leifsoniaxylisubsp.ryli.Lxx）的甘蔗为供试样品，提取的甘蔗总DNA里含有病原 细菌的DNA，可用于检测.
4试剂
除另有规定外，所用试剂均为分析纯.4.12×CTAB抽提缓冲液：含 100 mmol/L Tris-HCIpH 8.0).20 mmol/L EDTA，1. 4mol/L NaCl β-硫基乙醇.4.3.1F3:5′-ACATCGGTACGACTGGGT-3'.4.3.2B3:5′-TGGCCGACCAAAAAAGGT-3.4.3.3FIP(F1eF2);5'- GGCGTACTAAGTTCGAGCCGTT-GGTCAGCTCATGGGTGGA- 3'4.3.4BIP(B1cB2);5'-CCTCGCACATGCACGCTGTT-CTCAGCGTCTTGAAGACACA-3' 4.3.5LF:5'-CTCCGCACCAATGTCAATGT-3'.4.3.6LB5'-CTGAGGGACCGGACCTCATC-3'.4.4其他试剂：dNTPMixture（各10mmol/L)；含有10×Reaction Buffer（反应缓冲液）的Bsz DNA聚型染料SYBRGreenI(1000×）；乙醇；异丙醇；β-疏基乙醇；75%乙醇；液氮；过氧化氢（HO）.
2.0%CTAB，配方见附录A.该缓冲液在121C下热灭活20min~30min，使用前加入0.1%（V/V）的
4.2氯仿/异戊醇（V/V)=241.
4.3检测引物序列.
合酶：乙二胺四乙酸二钠（NaEDTA2HO）：6mol/L盐酸（HCI）；2mol/L氢氧化钠（NaOH）;嵌入
5仪器和设备
5.1高速台式冷冻离心机：相对离心力12000g以上，温度4C~8C.5.2常温离心机：相对离心力3000g以上.5.3小型离心机：可用于PCR反应管瞬间低速离心用的小型离心机.5.4微量加样器：0.1 pL~ 2.5 ulL.1 Ll~10 pl，2 μL~ 20 puL，10 pL~ 100 μL，20 μuL~ 200μL，5.5恒温水浴锅：要求具有显示温度的功能. 100 μl.~ 1 000 μl.5.6其他设备：冰箱（2C~4C和-20C）：高压灭菌锅；鼓风干燥箱；液氮罐；核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计：电子天平（感量0.001g）.5.7取样工具：砍刀、剪刀、镊子、带槽钻子、钳子.5.8耗材：离心管、PCR反应管、Tip头、滴管、100mL和1000mL容量瓶、100mL和1000mL细口瓶.
6检测方法
6.1样品的采集与前处理
6.1.1取样
（1.1×10²Pa）高压灭菌15min或160C干烤2h.取样过程中应避免样品交叉污染，每取1个样品后， 取样工具进行消毒处理，砍刀采用3%的HO溶液浸泡30min以上，其他工具采用（121土2）℃行样.样品采集后，置于一次性保鲜袋中，编号备用.
6.1.1.1蔗茎：采集中部蔗茎1节~2节，平行样的样品应采自同一蔗兜的不同植株.蔗茎去皮后，采用钳子直接挤压出汁.燕汁收集在5mL～10mL无菌离心管中.也可采用带槽钻子直接在田间甘蔗蔗 茎中部取汁.
2
6.1.1.2组培苗：小苗样品采集全株，株高超过25cm的也可采集叶片，2叶为1份.
6.1.1.3叶片：采集甘蔗植株中部带有中脉的叶片，1片为1份，平行样的样品应采自同一蔗兜的不同 植株.
6.1.2对照材料
6.1.2.1阳性对照：用已知含甘蔗宿根矮化病原菌的样品做阳性对照.6.1.2.2阴性对照：用已知不含甘蔗宿根矮化病原菌的样品做阴性对照.6.1.2.3空白对照：用等体积的无菌ddHO替代样品做空白对照.
6.1.3样品存放与运送
运送，可采用保温箱中加冰块密封后运送， 样品采集后，应放置在4C左右的冰箱中，建议在1d进行后续操作，但可以延长到4d.若需长途
6.2总DNA提取
6.2.1取数支2.0mL无菌离心管，并进行缩号.
6.2.2称取0.2g甘蔗组培苗和叶片样品，加人液氮研磨成粉末状（研磨过程要保持液氮不挥发干心10min，弃上清液，留下沉淀，备用.
6.2.3向装有样品的离心管中加入800gL预热（约65C）的2XCTAB抽提缓冲液，充分摇匀.65℃保温40min，保温期间，每隔5min颠倒3次~4次混匀.
6.2.44C下12000g离心10min.弃沉淀，取上清液移至新的无菌离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇（V/V=24：1）.剧烈振荡30s
6.2.5吸取上层清液至另一新的无菌离心管中，加人2/3体积预冷（-20℃）的异丙醇或2倍体积的100%乙醇，轻轻倒混匀.于-20C下放置30min或4C~8C下静置过夜，待DNA析出.
6.2.64C下12000g离心15min，获得DNA沉淀.用500gL75%乙醇将DNA洗涤2次.4C下4500g离心5min，弃去上清液，晾干或用灭菌过的滤纸吸干后，加灭菌双蒸水50gl溶解（大约0.5h），得到样品DNA溶液.
6.2.7取样品DNA溶液5.0gL，加无菌水稀释至1.0mL，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计，测定波长260nm和280nm处的吸光值As和Aso，Aso/A比值在1.7~2.1才能用于后续试验.如该比值不在此区间，说明质量不符合要求，应重新制备样品DNA溶液.DNA浓度按式（1）计算.
式中：
c-DNA浓度，单位为微克每微升（pg/pL）：A--260nm处的吸光值；N-DNA稀释倍数，本操作稀释倍数为200.
将样品DNA溶液的浓度调整到20ng/μL左右.置一20C保存备用.
6.3环介导等温扩增
6.3.1在冰上融化各反应组分，瞬间低速离心（约2000g下离心3s-5s，下同），根据测试样品数量，计算好各试剂的使用量，每份样品应设置2个平行反应.
6.3.2除样品外，按附录B配制反应混合液，全部加完并充分混合均匀后，盖上离心管的盖子，瞬间低速离心.再打开离心管的盖子，用微量加样器向每个PCR反应管中各分装24.0.
6.3.3在已设定的PCR反应管中分别加人样品DNA溶液各1.0uL.空白对照加1.0μL.无菌ddHO代替样品DNA溶液，盖上PCR反应管的盖子，瞬间低速离心.
