NY
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 2795-2015
苹果中主要酚类物质的测定 高效液相色谱法
Determination of major phenolic pounds in apple-High performance liquid chromatography
中华人民共和国农业部发布
前言
本标准由农业部加工局提出并归口. 本标准起草单位：中国农业科学院农产品加工研究所、中国农业科学院果树研究所.本标准主要起草人：刘酸、毕金峰、陈芹芹、吴昕烨、邓健康、聂继云、易建勇、周林燕、郑金铠、周沫、
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
李静.
苹果中主要酚类物质的测定 高效液相色谱法
1范围
本标准规定了苹果中主要酚类物质的高效液相色谱测定方法.
本标准适用于苹果中没食子酸、原儿茶酸、新绿原酸、原花青素B1、儿茶素、绿原酸、原花青素B2、咖啡酸、表儿茶素、p-香豆酸、芦丁、阿魏酸、皮、根皮苷、皮素和根皮素等单个或多个组分含量的测定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
苹果中的主要酚类物质经乙醇溶液提取，C固相萃取柱净化、定容，微孔滤膜过滤，高效液相色谱法测定，外标法定量.
4试剂和材料
除非另有说明，本标准所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1试剂
4.1.1乙醇（CH CHOH.CAS号：64-7-5).4.1.2乙腊（CHCN CAS号：75-05-8).色谱纯.4.1.3甲醇（CH OH.CAS号：67-56-1)，色谱纯.4.1.4甲酸（HCOOH.CAS号：64-18-6)，色谱纯.
4.2试剂配制
4.2.1乙醇溶液（82)；取80mL乙醇（4.1.1）加人20mL水中.混匀.4.2.2甲酸溶液（2%.体积分数）：取2mL甲酸（4.1.4）.用水稀释至100mL，4.2.3甲酸一乙晴溶液（955）：取95mL甲酸溶液（4.2.2）.加入5mL乙晴中.混匀.
4.3.1没食子酸（C HO），纯度>98%.4.3.2原儿茶酸（C HO），纯度≥99%. 4.3.3新绿原酸（CHO），纯度≥98%.4.3.4原花青素B1（CHO），纯度≥95%.4.3.5儿茶素（CHO）.纯度≥98%.4.3.6绿原酸（CHO ）.纯度≥95%.4.3.7原花青素B2（CHO），纯度≥98%.
NY/T 2795-2015
4.3.8咖啡酸（C HO），纯度≥95%.4.3.9表儿茶素（C；HO）.纯度≥98%4.3.10p-香豆酸（C HO)，纯度≥98%.4.3.11芦丁（CHO），纯度≥98%4.3.12阿魏酸（CHO ）.纯度≥99%4.3.13皮苷（CHO）、纯度≥98%.4.3.14根皮苷（CHO），纯度≥98%.4.3.15榭皮素（CHO ），纯度≥98%. 4.3.16根皮素（CHO）.纯度≥99%.
4.4标准溶液配制
4.4.12mg/mL单一酚类物质标准储备溶液：分别准确称取酚类物质标准品（4.3）10mg（精确到
0.0001g），于5mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.1.3）溶解并稀释至刻度，配制成质量浓度为2mg/mL的单一酚类物质标准储备溶液.一20℃以下避光贮存，有效期一个月.4.4.20.1mg/mL酚类物质混合标准中间溶液：分别准确吸取0.1mL单一酚类物质标准储备溶液 （4.4.1）于2mL.棕色容量瓶中，用甲醇（4.4）稀释至刻度.配置成质量浓度为0.1mg/mL酚类物质混合标准中间溶液.一20℃以下避光贮存，有效期一周.4.4.3酚类物质标准工作溶液：分别吸取酚类物质混合标准中间溶液（4.4.2）0.02ml、0.1mL、0.2mL、0.4mL、1.0mL至2mL棕色容量瓶中，用甲酸一乙晴溶液（4.2.3）定容至刻度，配制成质量浓度为1mg/L.、5mg/L、10mg/L.、20mg/L和50mg/I.的系列混合标准工作溶液.现配现用.4.5.1C固相萃取柱. 4.5材料4.5.2滤膜：0.45μm，有机相.
5仪器
5.1液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器.5.2分析天平：感量0.0001g、感量0.01g.5.3研磨仪.5.4离心机：转速可达到10000r/min. 5.5漩涡混合器.5.6旋转蒸发器.5.7超声波萃取仪：工作频率40kHz，功率500W.5.8固相萃取器.5.9圆底烧瓶；100ml5.10聚四氮乙烯离心管：50ml
6试样制备与保存
将苹果样品，用干净纱布轻轻将样品表面擦净，按取样要求取200g样品采用对角线分割法，取对角部分，将其切碎，充分混均，再用四分法取样，用液氮冷冻后，于研磨仪中研磨成粉末，装入聚乙烯塑料瓶，一20℃以下保存，备用.
7分析步骤
7.1提取
称取试样5g（精确到0.01g）于50mL聚四氟乙烯离心管中.加人20mL乙醇溶液（4.2.1）.用涡混合器充分混合，室温下超声提取15min，以10000r/min转速、4C离心10min，上清液倒人50mL棕色容量瓶中，重复提取1次，上清液合并转人50mL棕色容量瓶中，用乙醇溶液（4.2.1）定容至50ml备用.
7.2浓缩
温度≤40℃.待净化. 准确吸取10ml.样品提取液（7.1）于100mL圆底烧瓶中，在旋转蒸发器上减压蒸发至除去乙醇，
7.3净化
将C固相萃取柱放在固相萃取器上，依次用5mL甲醇（4.1.3）和5mL水活化.控制流速1mL/min.将待净化液（7.2）加入固相萃取柱中.用5mL水清洗旋转蒸发后的圆底烧瓶，加入固相萃取柱中，用3mL水淋洗，弃去：再用5mL甲醇（4.1.3）分2次清洗圆底烧瓶，加入到固相萃取柱中，收集洗脱液至10mL棕色容量瓶中并定容，过0.45μm有机相微孔滤膜，供高效液相色谱测定.
7.4液相色谱参考条件
色谱柱：C色谱柱，4.6mm×250mm.粒径5μm.或相当者；流动相：A为2%甲酸溶液，B为乙睛，用前过0.45um滤膜，脱气，梯度洗脱程序见表1.
表1流动相梯度洗脱程序（VVn）
时间tmin 0 A B 530 96 75 2545 50 60 60 40 4051 95 560 95
柱温：40°℃；检测波长：280nm，320nm，360nm; 流速：0.8mL/min;进样量：10pL
苹果中各主要酚类物质在其最佳定量波长下进行检测，各酚类物质的最佳定量波长见附录A.
7.5标准工作曲线
纵坐标，对应的标准溶液质量浓度（mg/L）为横坐标，绘制标准曲线.求回归方程和相关系数.
7.6测定
做3份试料的平行测定，取10ul.试样溶液和相应的标准工作溶液在与标准相同的色谱条件下进行测定，以色谱峰保留时间定性，以色谱峰峰面积定量.标准工作溶液的高效液相色谱图参见附录B.同时做空白试验，除不称取试料外，均按7.1~7.3操作步骤进行测定.
8结果计算
苹果中被测酚类物质以质量分数计，单位以毫克每干克（mg/kg）表示，按式（1）计算.
