中华人民共和国农业行业标准
NY/T3293-2018
黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程
Technicalregulationsfor activityidentification ofbiocontrol strains againstAspergillus flavus
中华人民共和国农业农村部发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准由农业农村部种植业管理司提出并归口.
本标准起草单位：中国农业科学院油料作物研究所、国家农业检测基准实验室（生物毒素）、农业农村部油料产品质量安全风险评估实验室（武汉）、农业农村部油料及制品质量监督检验测试中心.
本标准主要起草人：李培武、张奇、岳晓凤、余秋玉、喻理、白艺珍.
黄曲霉生防菌活性鉴定技术规程
1范围
本标准规定了黄曲霉生防真菌（霉菌及酵母）细菌和放线菌活性的鉴定方法.本标准适用于真菌类（霉菌及醇母）、细菌类和放线菌类生防菌对黄曲霉生防活性的鉴定.
2规范性引用文件
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件.凡是不注日期的引用文件 BL/8
GB4789.3食品安全 GB4789.15食品 国家GB4789.281 食品安全 全 质GB5009.22 食品安 族的GB/T6682 分析 至用 规格和GB19489实验室 NY/T2310 黄曲 侵染抗性 全通用
3原理
RA将生防菌株与产 生防菌对黄曲霉菌丝生长、分 发、 侵染及产毒的抑制率，鉴定黄 电监生
4培养基、试剂及材率 UL
4.70.1%次氯酸钠：参见A7.
4.8无菌水：121C灭菌20min，备用.
4.9黄曲霉菌株：Aspergilusflaus strain3.4408，能产生黄曲霉毒素B、黄曲霉毒素B、黄曲霉毒 素G和黄曲霉毒素G
4.10大肠杆菌菌株：Escherichia coli TOP10F”.
4.11待测生防菌株.
5仪器设备
5.1生物安全柜：二级.
5.2高压灭菌锅.
NY/T3293-2018
5.3恒温恒湿培养箱.5.4恒温摇床.5.8电子天平：感量±0.01g.感量士0.0001g. 5.9pH计.5.10无菌锥形瓶：容量50mL，容量500ml.5.12无菌培养皿：内径90mm5.13微量移液器及枪头：10gL 200L，1ml5.14无菌打孔器：内径6mm.5.15无菌滤纸片：直径6mm，直径9cm. 5.16血球计数板.5.17直尺：量程20 cm.
5.5烘箱.
5.6高速粉碎机.
5.7生物显微镜：物镜4倍~100倍.
5.11烧杯：容量100mL.
6菌种准备
6.1黄曲霉菌饼准备
打孔器在菌落边缘制取直径6mm的菌饼，备用. 生物安全柜中接种黄曲霉菌株于平板PDA培养基上，30C、相对湿度90%、黑暗培养4d.用无菌
6.2黄曲霉分生孢子悬浮液配制
将6.1中接种黄曲霉的平板，在30℃、相对湿度90%、黑暗中培养7d，用5mL吐温水溶液洗脱分生孢子.用血球计数板在生物显微镜下计数，调整孢子浓度为1×10个/mL和1×10°个/mL，备用.
6.3大肠杆菌菌悬液配制
度稀释，按GB4789.3中规定的大肠菌群平板计数法计算菌体浓度，调整菌体浓度为1×10CFU/mL 生物安全柜中接种大肠杆菌于LB液体培养基中，37C、200r/min振荡培养24h后，10倍系列梯和1×10CFU/mL，备用.
6.4生防菌株培养及菌悬液配制
6.4.1生防菌株培养
类生防菌株培养. 按GB4789.28的规定选择适宜的培养基和培养条件进行真菌类（霉菌和酵母菌）细菌类、放线菌
6.4.2生防菌悬液配制
6.4.2.1真菌类生防菌
霉菌类生防菌产孢培养后，进行分生孢子洗脱，洗脱方法同6.2.按GB4789.15的规定对霉菌分生孢子及6.4.1中培养的酵母进行计数，配制霉菌分生孢子及酵母菌悬浮液，浓度为1×10CFU/mL和1×10²CFU/mL，备用.
6.4.2.2细菌类生防菌
配制细菌类生防菌菌悬液，浓度为1X10CFU/mL和1X10CFU/mL.配制方法同6.3.备用
6.4.2.3放线菌类生防菌
无菌滤纸片过滤，获得孢子悬浮液，调整孢子浓度为1X10CFU/mL和1X10CFU/mL.配制方法同 生物安全柜中接种放线菌于高氏1号平板培养基上，30C培养7d，用吐温水溶液刮洗孢子和菌丝，2
6.4.2.1，备用.
7黄曲霉生防菌株活性鉴定方法
7.1平板对崎培养
7.1.1接种
挑取黄曲霉菌饼倒置于平板PDA培养基中央，将四片直径6mm的无菌滤纸片分别对称放于距PDA平板中心25mm处，滤纸片上分别滴加10gL1×10²CFU/mL生防菌株菌悬液（处理组）：以在滤纸片上滴加10L无菌水为对照组，其他操作同处理组.
7.1.2培养
于恒温恒湿培养箱中30℃、相对湿度90%、黑暗培养6d.
7.1.3测定菌落直径
分别用直尺以十字交叉法测量处理组与对照组中黄曲霉菌落直径.
7.1.4结果计算
按式（1）计算生防菌株对黄曲霉菌丝生长的抑制率.
式中：
X-黄曲霉菌丝生长抑制百分率，单位为百分率（%）；
D-对照组黄曲霉菌落直径，单位为毫米（mm）；
D-处理组黄曲霉菌落直径，单位为毫米（mm）.
7.2液体共培养
7.2.1接种
分别取200gL1X10CFU/mL生防菌株菌悬液和1×10个/mL黄曲霉孢子悬浮液同时接种于20mL沙氏液体培养基中（处理组）：以接种无菌水和黄曲霉孢子悬浮液为对照组1；以接种大肠杆菌菌悬液和黄曲霉孢子悬浮液为对照组2，其他操作同处理组.
7.2.2培养
于恒温摇床中30℃、200r/min黑暗振荡培养6h、18h和4d
7.2.3统计黄曲霉分生孢子萌发数
分别在振荡培养6h和18h后，每个处理显微镜下随机观察并统计200个黄曲霉孢子的萌发情况.
振荡培养4d后，用无菌滤纸片过滤培养液，过滤后的菌丝于烘箱中55℃烘干24h，电子天平称量菌丝干重.
7.2.5测定黄曲霉毒素浓度
取2mL7.2.4中过滤后的滤液，按GB5009.22的规定测定黄曲霉毒素浓度.
7.2.6结果计算
按式（2）计算细菌和酵母类生防菌株对黄曲霉孢子萌发的抑制率.
(2)
式中：
X-黄曲霉孢子萌发抑制百分率，单位为百分率（%）；
G一对照组黄曲霉孢子萌发数；
G一-处理组黄曲霉孢子萌发数
