中华人民共和国农业行业标准
驴骤马源性成分鉴定 实时荧光定性PCR法
Identification of donkey mule/hinny and horse derived materialsReal-time qualitativePCRmethod
中华人民共和国农业农村部发布
公共服务平台食典通本文件按照GB/T1.1-2020标准化 作作则 第1部分 结构和起草规则》的规定起草.
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出.
本文件由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口.
本文件起草单位：山东省农业科学院生物技术研究中心.
本文件主要起草人：张全芳、胡悦、范阳阳、刘艳艳、谭晴晴、杨雪、陈雪燕、刘国霞、陈淑娟、谷玉霞、杨连群、王俊燕、步迅.
驴骤马源性成分鉴定实时荧光定性PCR法
1范围
本文件规定了驴、骤和马3种动物源性成分的实时荧光定性PCR检测方法. 本文件适用于动物肉、皮、毛中驴、骤和马3种动物源性成分的定性检测.
本方法定性检出限为1%.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中 少的条款 其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于 文件 的规范 必不 包括 新有的修改单）适用于本文件.
GB/T 27403 实验室
3术语和定义
3. 1
实时荧光PCR retin hePCR
在聚合酶链式反 CR进程，对未知模板进行定性或定量分析 的体系中
3.2
循环数阅值cyclehrshl
每个反应管内的荧光信号达到设3.3 c
肌肉肌酸激酶基因 Cea
4原理
为的特异性TaqMan探针，采用实时荧光PCR技术进 根据驴和马的核基因设计马属通用引物，在差异位 信号及 制设计费 满值，判定试样中含有驴、骤和马3种动物源性成分的情况.
5试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂.
5.1水：GB/T6682.一级水.
5.2Tris-HCl缓冲液（1mol/L.pH 6.4）：称取12.10gTris置于100ml.烧杯中，加人80mL水、用盐酸调节pH至6.4.加水定容至100mL，103.4kPa蒸汽压（121“C）灭菌20min，室温保存待用.
5.3Tris-HCl缓冲液（0.5mol/L pH 8.0）：称取6.05gTris置于100ml烧杯中 加入80mL水，用盐酸调节pH至8.0.加水定容至100mL.103.4kPa蒸汽压（121C）灭菌20min.室温保存待用.
5.4EDTA缓冲液（0.5mol/L pH 8.0）：称取18.61gNaEDTA2HO置于100ml.烧杯中，加人80ml.水，用10%的NaOH溶液，调节pH至8.0，加水定容至100mL 103.4kPa蒸汽压（121C）灭菌
20min，室温保存待用.
5.5十二烷基磺酸钠溶液（SDS.10%）：称取10.00gSDS溶解于80mL水中，加水定容至100ml. 103.4kPa蒸汽压（121“C）灭菌20min.室温保存待用.
kPa蒸汽压（121C）灭菌20min，室温保存待用.
5.7细胞裂解液1：取Tris-HCI(0.5 mol/L pH 8.0）缓冲液20ml、EDTA（0.5 mol/ L. pH 8.0）缓冲液5ml、NaCI溶液（5.0mol/L)10ml、10%SDS溶液5ml. 加水定容至100ml.
5.8细胞裂解液Ⅱ：取Tris-HCI(0.5 mol/L pH 8.0）缓冲液40 mL、EDTA（0.5 mol/L.pH 8.0）缓冲液5 mL、NaCI溶液（5. 0 mol/L)10 mlL.、10% SDS 溶液5 mL. 加水定容至 100 ml
5.9蛋白酶K溶液（20mg/mL）：称取0.20g蛋白酶冻干品，加水溶解，加水定容至10ml.，分装后于-20C保存.
5.10RNA酶溶液：称取1.00g冻干品RNA酶A溶解于6mL.水中，于100C加热15min，缓慢冷却至 室温，加水定容至10ml.分装成小份存于一20℃.
5.11二硫苏糖醇（DTT.1mol/L）：称取1.54gDTT，加入6mL.水溶解，加水定容至10ml..分装后于-20℃保存.
5.12硅珠悬浮液：称取5.00g的硅珠加人20ml.水中充分混合，静置24h，弃掉上清液，然后加人20mL水中充分混合，再静置5h，弃掉上清液.在沉淀的硅珠中加人5ml水，用盐酸调节pH至2.0.
5.13Chclex-100树脂（5%）：称取5.00gChclex-100树脂，溶解于水中，加水定容至100ml
5.14DNA结合液：称取60.00g异硫氰酸胍（GUSCN），依次加人Tris-HCI缓冲液（1mol/L.pH6.4)5mL、EDTA缓冲液（0.5mol/L pH 8.0）8mL、TritonX-100溶液（60C）4ml 加水定容至100ml.
5.15漂洗液：称取60.00g异硫氰酸胍（GUSCN)，加人Tris-HCl缓冲液（1mol/L.pH6.4）5mL，再加人EITA缓冲液（0.5mol/1. pH8.0）8mL 加水定容至100ml.
5.1670%乙醇：量取70ml无水乙醇，加人30ml水.
5.17TE缓冲液：依次加人Tris-HCI级冲液（0.5 mol/L pH 8.0)1ml. EDTA缓冲液（0.5 mol/1. pH8.0）0.1ml，加水定容至50mL.103.4kPa蒸汽压（121C）灭菌20min，降至室温，4C保存备用.
5.180.5%洗毛剂：取100ml.5%的商品化洗毛剂原液，加水900ml.
5.19实时荧光PCR检测试剂盒试剂：2XTaqManMaster Mix.含有TaqDNA聚合酶（终浓度1U/ 20l），Mg²（终浓度2.0mmol/μL），dNTPs（终浓度0.2mmol/L），驴、和马3种动物源性DNA阳性标准品.
5.20检测用引物和探针：外源质控引物探针序列和驴、骤和马3种动物的通用引物和特异性探针序列见表1.引物探针在序列中的位置见附录A.
表1实时荧光定性PCR引物和探针序列
引物探针名称 缩写 序列（5′-3'） 扩增片段 bp外源质控引物-上游 EC-F S'-AGACCACCAAATGOXUCTATC-3' 140外源质控引物-下游 外源质控探针 EC-R EC-PS'CYS-GCGAGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGC-DAB 3 S'-CGAGATTGAGATCTTCTGCGAC-3通用引物-上游 cbm-F5'-TCATCGTAGCATOGAGGGG-3′ 217通用引物下游 驴源性探针 chm-R5'-AGCAGAGCAGGAAGGGAGTT-3′ Lv-P 5'-JOE-ATAGTTGAAGGTTCTGAAAATTTTTAGGCAAAGOCT-BHQ2 3′马源性探针 M-P5'-FAM-ATAGTTGAAGCTTCTGAAAATTTTTAGGTAAAGCCT-DAB 3”
5.21外源质粒：利用水将人工合成的外源质粒稀释至2×10ng/μl. 外源质粒序列见附录A
6仪器与设备
6.1实时荧光PCR仪：4通道以上（应能检测FAM、JOE和CY5荧光）.
6.2紫外分光光度计：波长190nm~900nm.6.3分析天平：感量0.0001g和0.01g. 6.4离心机：最大转速不小于13000g.6.6高压灭菌锅.
6.5振荡型恒温金属浴.
7试验步骤
7.1试样制备
7.1.1肉类试样制备
称取肉类样品约2.00g，用灭菌的生理盐水清洗后，在液氮中充分研磨成粉末.
7.1.2皮类试样制备
盐干皮或释制皮张在平整处边缘取约2.00g，去除毛、脂肪，将试样在水中浸泡20min，用水清洗2次，剪成直径约5mm左右小块，在液氮中充分研磨成粉末.
7.1.3毛类试样制备
称取带毛囊的毛类样品约0.50g，置人0.5%洗毛剂（5.18）中，用超声波清洗干净，再用水冲洗3min~5min，至无泡沫.在无水乙醇中浸泡约5min.室温放置.将样品剪碎，在液氮中充分研磨成粉末，
7.2DNA提取
7.2.1对照样品DNA提取
DNA提取过程中同时设置空白对照、阴性对照和和阳性对照，各对照组成如下：
a）空白对照：水；b）阴性对照：驴、螺和马以外的样品；e）阳性对照：驴、骤和马的等质量混合样品.
7.2.2肉、皮类试样DNA提取
称取约30mg粉末装人2ml.的离心管中，每个样品设立2个平行样，加入400pl.细胞裂解液1（5.7）、10gl.蛋白酶K溶液（5.9）混匀，56C水浴2h，其间不时轻微摇匀.12000g离心5min，吸取上清液转至新的1.5ml离心管中，加人10pl.硅珠悬浮液（5.12）及800pLDNA结合液（5.14），充分混次；8000g离心30s，吸走残余液体，室温放置10min，使残余乙醇完全挥发，加人50gl.TE缓冲液 离心1min，弃上清液.加人700gl.的70%乙醇（5.16）洗涤，8000g离心1min弃上清液，重复此步骤2（5.17）溶解DNA，加人1pl.RNA酶溶液（5.10)，37C水浴5min，8000g离心1min，吸取上清液转移至新的离心管中，一20C保存备用.
注：提取DNA也可采用经验证等效的动物组织DNA提取试剂盒，按照试制盒使用说明书提取.
7.2.3毛类试样DNA提取
称取10mg~50mg毛类试样粉末至2mL离心管中，每个样平行提取2管，加人400gl.细胞裂解液Ⅱ（5.8）、10pl蛋白酶K溶液（5.9）、10gL.二硫苏糖醇（DTT.1mol/L）（5.11），混匀，放至振荡型恒温金属浴中，56C800r/min裂解3h~5h，直至毛发完全裂解.加100gl.Chelex-100树脂（5%）（5.13），煮沸8min，8000g离心3min取上清液至新的1.5mL离心管中.加入硅珠悬浮液（5.12）10pl. 加 800gLDNA结合液（5.14），充分混匀，室温静置5min，8 000g离心1min:加人700l.漂洗液（5.15），涡旋振荡悬浮，8000g离心1min.弃上清液；加人700gl.70%乙醇（5.16）洗涤，8000g离心1min弃上清液，重复此步骤2次；8000g离心30s，吸走残余液体，室温放置10min，使残余乙醇完全挥发，加入50 glL TE缓冲液（5.17）溶解DNA.加人1 lL.RNA酶溶液（5.10)，37C水浴5min，8 000g 离心1 min，吸取上清液转移至新的离心管中，一20C保存备用.
注：提取DNA也可采用经验证等效的动物组织DNA提取试剂盒，按照试剂盒使用说明书提取.
