中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T1870-2016 替代SN/T1870-2007
出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法
Method for the detection ofpathogens in foodfor exportReal-time PCRmethod
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准参考美国FDA细菌学分析手册第二十九章阪崎克罗诺杆菌2012（Chapter 29：Cronobacter 2012of FDABacteriologicalAnalyticalManual)，对原标准文本格式、某些文字表述和文本内容进行修订.
本标准代替SN/T1870-2007（食品中致病菌检测方法实时荧光PCR法》
本标准与SN/T1870-2007相比主要变化如下：
增加了阪崎克罗诺杆菌的实时荧光PCR检测方法.增加了DNA浓度和纯度的测定.修改了实时PCR反应体系.删除了“测定低限”
一防止交叉污染的措施改为“按照SN/T1193的规定执行"并删除附录B.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、深圳太太基因工程有限公司.
本标准主要起草人：曹际娟、贾俊涛、倪长鹏、郑秋月、徐君怡、肖性龙、张经纬.
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：
SN/T 1870-2007.
出口食品中食源性致病菌检测方法 实时荧光PCR法
1范围
本标准规定了食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌O157：H7、霍乱弧菌、阪崎克罗诺杆菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的实时荧光PCR检测方法.
菌、空肠弯曲菌、单核细胞增生李斯特氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌0157：H7、霍乱弧菌、阪崎克罗诺杆 本标准适用于食品中沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、创伤弧菌和溶藻弧菌的快速检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB4789.4食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验GB4789.5食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验GB4789.7食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验 GB/T4789.8食品卫生微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验GB4789.9食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验GB4789.10食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验GB4789.40食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验 GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测SN/T0973进出口肉、肉制品以及其他食品中肠出血性大肠杆菌O157：H7检测方法 SN/T1022进出口食品中霍乱弧菌检验方法NMKLNo.156食品中致病性弧菌的检测和计数
3术语、定义和缩略语
下列术语、定义和缩略语适用于本文件.
3.1术语和定义
3.1.1
实时荧光PCRreal timePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程.
SN/T 1870-2016
3.1.2
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数.
3.2缩略语
C：值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（C：Cyele.1threshold）dATP：脱氧腺菲三磷酸（deoxyadenosine triphosphate) dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphnte）DNA：脱氧核糖核酸（deoxribonuleicacid）.dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridinetriphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（de oxythymidine triphosphate)FAM：6-基荧光素（6-carboxyfluoresceiPCR：聚合酶链式反应，简称PCR（ lymerase chair reaction)TAMRA；6-俊基四甲基罗丹明 6-carboxytetr nethylrhodamine)Tris:三（羟甲基）氨基甲烷 Taq：水生栖热菌（Therms tris(hydroxy methylaminomethane aqnaticus)UNG：尿喀啶N-糖基化酶 uracil N-glycosylase)
4方法提要
在PCR基础上，加人一条与模扳DNA匹配的、两滴有荧光基团标记的寡核苷酸探针.PCR每进行一次循环，合成的新链数与释放的荧光基团数呈对应关系，即PCR产物的量与荧光信号的强度呈对应关系.当荧光信号超过所设定的值（Threshold-value）时：荧光信号可被检测出来，仪器检测荧光基团的增加量可以间接地体现目的片段的扩增量.
样品的模板DNA进行实时荧光PCR扩增，观察实时PCR的增幅曲线，从而对食品中的致病菌进行快速检测.
5仪器和设备
5.2 离心机：离心转速≥12000r/min5.3微量移液器：10pL、100μL、200pL、1000l5.4恒湿培养箱. 5.5高压灭菌器.5.6核酸蛋白分析仅或紫外分光光度计.5.7恒湿水浴锅.5.8天平：感量0.01g.
5.1实时荧光PCR仪.
6试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂.实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格.试
剂均用无DNA酶污染的容器分装.
6.1Taq DNA 聚合酶.
6.2dNTP:dATP dTTP dCTP dGTP
6.3DNA提取试剂：称取0.1gchelex100粉末，加人100mL灭菌蒸水中，摇匀即可.也可使用商业化的DNA提取试剂盒.
6.410×PCR 缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl(pH8.4) 200 mmol/L KC1.15 mmol/L. MgCl.
6.5引物和探针：引物和探针序列见附录A中的表A.1.其中探针的5端标记FAM，3*端标记TAM-RA.
注：探计的荧光标记物可根据基因扩增仅功能的不同进行调整.
7检测步骤
7.1样品制备、增菌培养和分离
沙门氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤按照GB4789.4进行.志贺氏菌的样品制备、增菌培养和分离步按照GB4789.5进行.金黄色葡萄球菌的样品制备、增菌培养和分离步骤按照GB4789.10进行.小肠结肠炎耶尔森氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤按照GB/T4789.8进行. 副溶血性弧菌的样品制备、增前培养和分离步骤按照GB4789.7 进行.空肠弯曲菌的样品制备、增菌培养和分离步骤按照GB4789.9单核细胞增生李斯特氏菌的样品制备、增菌培养和分离步骤按照GB4789.30进行.霍乱弧菌的样品制备、增菌培养和分离步骤按照SN/T1022进 肠出血性大肠杆菌0157：H7的样品制备、增培养和分离步 骤按照SN/T0973进行.阪崎克罗诺杆菌的样品制备增菌培养和分离步按照GB4789 40进行.创伤弧菌和溶藻弧菌的样品制备、增菌培和分离步骤按照NMKLNo.156进行.适宜的条件下，保留一份增菌液以备PCR结果阳性时，采用其他方法进行验证.
7.2模板DNA的制备
7.2.1增菌液模板DNA的制备
取7.1中培养的相应致病菌增商液（需二次培养的则取二 次增菌液）1ml.加到1.5ml.无菌离心管中.8000r/min离心5min.吸弃上清：加人50pL.DNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取）.混匀后沸水浴5min，12000r/min离心5min.取上清保存于-20C备用以待检测.
7.2.2可疑菌落模板DNA的制备
挑取7.1中分离到的可疑菌落或菌体，加人50LDNA提取液，再按照7.2.1步骤制备模板DNA以待检测.
也可使用商业化的DNA提取试剂盒并按其说明制备模板DNA.
7.3DNA浓度和纯度的测定
取适量DNA溶液原液加双蒸水稀释一定倍数后使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260nm和280nm处的吸收值.DNA的浓度按照式（1）计算.
