中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T3578-2013
大豆猝死综合症北美种活性检测方法
ViabilitydetecionofFusariumvirguliformeO'DonnelletT.Aoki
中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、广东省微生物研究所、中国检验检疫科学研究院.
本标准主要起草人：章桂明、王颖、程颖慧、陈枝楠、仲建忠、李秋枫、向才玉、代京莎、汪莹、陈洪俊.
大豆猝死综合症北美种活性检测方法
1范围
本标准规定了应用激光扫描共聚焦显微镜对大豆猝死综合症病菌北美种（FusariumvirguliformeO'DonnelletT.Aoki）的活性进行检测的方法.
本标准适用于大豆猝死综合症病菌北美种相关寄主中携带的大豆死综合症病菌北美种的活性检测鉴定.
2 原理
应用荧光染料对病原菌镰刀形分生孢子进行染色处理，根据大豆猝死综合症北美种病菌不具活性的孢子染上荧光、具有活性的孢子不染上荧光的染色效果差异的特点，运用激光扫描共聚焦显微镜对病菌孢子进行检测，分析其活性情况.
3 3仪器用具和试剂
3.1仪器用具
激光扫描共聚焦显微镜、显微镜、高压灭菌锅、生物安全柜、生化培养箱、冰箱.
3.2试剂
碘化丙啶（PI）、二甲基亚枫（DMSO）、琼脂粉
4活性检验方法
4.1病原菌孢子获取
在显微镜下，将发现确定为大豆猝死综合症病菌北美种镰刀形分生孢子挑到灭菌水中，配制成浓度大于1个孢子/uL的孢子悬浮液，镜检，备用.
4.2孢子染色
取1μL碘化丙啶染料（以DMSO为溶剂，浓度为0.5mmol/L）加人200μL孢子悬浮液中，混匀，室温下避光染色15min，16000g离心1min去上清液终止染色，灭菌去离子水洗涤一次，重悬，孢子浓度大于1个孢子/uL.避光放置备用.
4.3激光扫描共聚焦显微镜活性检测
4.3.1将完成染色样品制备玻片，封片，倒置于激光扫描共聚焦显微镜载物台上，低倍镜下找到孢子，转到100倍油镜下观察，微调至视野内图像清晰.
4.3.2选择相应的激光管（氩离子激光器）激发荧光信号，设置荧光通道的激发波长（488nm），收集荧光信号的发射波长（560nm），并设置一个明场通道作为对照.
SN/T-3578-2013
4.3.3选择低像素的平面扫描方式进行粗略扫描（xy：512×512），依据扫描成像效果中荧光信号强弱可调整探测针孔（Pinhole：1AU，即1AiryUnits=0.8μm）、光电倍增管增益（Gain：560）、激光扫描强度（ScanStr：5%），根据图像信噪比调整扫描模式（line）、重复扫描次数（Average：2）和扫描速度（Scanspeed:6)
4.3.4调整至成像质量较好时，再用精确扫描方式（xy：2048×2048）获取最终图像.
4.3.5扫描至少30个孢子，观察染色情况.
注：为了保证图像能够反映出孢子最真实的荧光染色情况，特别需要观察明场通道下所得孢子图像是否清晰.
4.4孢子萌发
取孢子悬浮液100uL，均匀涂布于水琼脂培养基上，用封口膜封口，24℃光照培养16h~18h，观察孢子萌发情况.
5结果判断与表述
结果判断与表述如下：
孢子染色后通过激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个孢子，所扫描的孢子中，检测到没有荧光的孢子（参见附录A中图A.1），判定大豆猝死综合症病菌北美种孢子具有活性；孢子染色后通过激光共聚焦显微镜随机扫描至少30个孢子，孢子均呈红色荧光（参见图A2），判定大豆猝死综合症病菌北美种孢子不具活性；激光共聚焦显微镜扫描结果无法判断孢子活性的，进行孢子萌发实验，根据萌发情况判定.
6样品与原始数据保存
6.1样品保存
存查样品应视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月.如发现具有活性的大豆猝死综合症病菌孢子的，该样品应保存1年，以备复验，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕.保存期满后，需经灭菌处理.
6.2原始数据保存
样品检测结束后其原始记录单和检验报告或证书应归档，妥善保管，以备复验、谈判和仲裁.
附录A
图A.1北美大豆猝死综合症病菌具活性的孢子染色图
图A.2北美大豆猝死综合症病菌不具活性的孢子染色图
