中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4417-2016
常见食品过敏原可视芯片检测方法
Food allergen detection with visual biosensor chips
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：陈额、韩建勋、王玮、邓婷婷、高宏伟、曾静、吴亚君、曹际娟、张舒亚、李志勇、候丽萍.
常见食品过敏原可视芯片检测方法
1范围
本标准规定了食品中大豆、花生、小麦、腰果、牛、鱼、鸡、虾等8种常见食品过敏原成分的可视芯片检测方法.
本标准适用于检测糕点、巧克力等食品中8种食品过敏原成分的定性检测，其他食品可参照使用.
本标准所规定方法的最低检出限（1.OD）为0.01%（质量分数）.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T27403-2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1.1
食品过敏原food allergen
食品中能使机体产生过敏反应的物质.常见食品过敏原主要包括大豆、花生、小麦、坚果、牛奶、鱼、蛋类及甲壳纲动物等八大类重要过敏原.
3.1.2
可视芯片visual biosensor chips
式点样于活化的薄膜表面，即成为可视芯片，用生物素标记的样品核酸与芯片上捕获探针进行特异性 在平滑的基片表面均匀包覆一层100nm~1000nm厚度的透明薄膜，并将捕获探针以矩阵的形杂交反应，然后加人酶-抗体复合物和酶底物溶液.在酶的催化下，芯片表面的探针点上原位沉积产生不溶物，引起薄膜表面厚度改变，继面导致探针点反射光的颜色改变，产生肉眼可见的杂交信号，完成样品检测.
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]EDTA;乙二胺四 乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)Taq：水生热柄菌（Thermus aquaticu）OD：光密度值（optical density)
SN/T 4417-2016
PCR：聚合酶链反应（polymerase chain reaetion）SSC：柠檬酸钠缓冲液（salt-sodium citrate）ATC：酸处理的酪蛋白（acid-treatedcasein）HRP：辣根过氧化酶（horseradish Peroxidase） TMB：四甲基联苯胺（tetramethylbenzidine）
4防污染措施
可视芯片方法检测过程的防污染措施应符合GB/T27403-2008中附录D的规定.
5方法提要
样品经研磨后，提取DNA.以DNA为模板，采用大豆Lecrin基因、小麦Gliadin基因、花生Arah3基因、腰果Anao3基因、鱼16SrRNA基因、虾16SrRNA基因、牛线粒体DNA基因和鸡线粒体DNA 基因设计和筛选特异性的引物和探针，基于多重PCR反应，对8种常见食品过敏原进行可视芯片高通量检测，根据芯片杂交信号，判断样品中是否存在常见的8种食品过敏原成分.
6可视芯片检测方法
6.1原理
将基标记探针固定在经过氨基化处理的芯片表面然后使用生物素标记的引物进行PCR扩增，扩增产物与芯片上的探针进行特定的杂交反应：接着用辣根过氧化酶抗体（HRP-antibody）处理，洗去未杂交的DNA链，加人四甲基联苯胺（TMB）处理，生物素标记的杂交DNA链在HRP-antibody和TMB的作用下产生沉淀面形成一层有机薄膜，这层薄膜通过改变芯片表面的厚度导致反射光的颜色 变化，从而产生肉眼可见的信号，而没在杂交成功的探针位点，无法结合抗体则无变化.
6.2仪器和设备
6.2.1PCR仪.6.2.2离心机：最大离心力≥16000g. 6.2.3微量移液器：2.5pL.10μL100p.200、1000L6.2.4冰箱：2C~8℃，-20.6.2.5高压灭菌器.6.2.6 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计.6.2.7 6.2.8 组织研磨器. 精密烘箱.6.2.9涡震荡器，6.2.10pH计.6.2.11天平：感量0.001g.
6.3试剂和材料
6.3.1 CTAB提取缓冲液：20g/L. CTAB. 1. 4 mol/L.NaC1.0. 1 mol/1.Tris-HCI. 0 02 mol/LNaEDTA用10%盐酸调pH至8.0.121C，高压灭菌20min.备用.6.3.2CTAB沉淀液：5g/L. CTAB.40mmol/LNsCl.121C，高压灭菌20min，备用.
6.3.3NaCl溶液：1.2mol/l6.3.4TE缓冲液（Tris-HC1、EDTA缓冲液）：10mmol/L. Tris-HCI(pH 8.0)，1 mmol/1.EDTA(pH8.0).6.3.5蛋白酶K：20mg/pl6.3.770%乙醇.6.3.8异丙醇（分析纯）.6.3.9 三氯甲烷（分析纯）.6.3.10 HotMaster Tag DNA 聚合酶. dNTPs混合液.6.3.1210×Multi Hotstart Buffer（含20 mmol/L Mg²） 6.3.116.3.1320×SSC溶液；3.0mol/1 NaCI.o.3mol/LC H.NaO6.3.14芯片杂交缓冲液：30ml.20×SSC溶液和12ml.ATC溶液加去离子水定容至120mL6.3.15SDS溶液：1mg/ml6.3.16可视芯片：表面涂布一层T结构聚合体的骤二甲基硅氧烷（T-structurepolydimethylsiloxane，6.3.17氨基修饰缓冲液：取2.5gpoly（phelys）和5.85gNaCl置于100mL烧杯中.加人50ml TSPS）基片.1XPBS缓冲液，充分搅拌溶解，4C保存备用.6.3.181×PBS缓冲液：8.0gNaCI.0.2gKCI.0.27gKHPO和1.42 g Nn HPO (pH 7.4).6.3.19常见食品过敏原成分扩增引物和探针详见表1.
6.3.6无水乙醇（分析纯）.
试验用引物和探针种类 引物和探针序列 目的基因上游引物：GCCCTCTACTCCAC CCCA3大豆 下游引物：5hiotin-GCCCA ATCTGC AAGCOTTTTT3 大豆Lctin基因探针：5'ALD-aaaaaaAGCTTCC CCGC TCCTTCAACTTOAC3”上游引物：5CGCAAAGTCAGCCTAGACAA3花生 探针：5ALD-aasaaaaaGAAGAGCGTGAATT 下游引物：5biotin-CTTGTO CTGCTCGTTCTCT TAGCCC CGAG ACAGCA3' 花生Ara A3 基因上游引物：5TGGTCTCATCCCTCTGGTCAA3小麦 下游引物：5biotin-GCTGCTGAGGAATCTGTGCTA3 小麦Giadin基因探；5'ALD-aaaaaasTGGCCACAAAGCGATTGCCAAGTGATGA3上游引物5*TGCCAGGAGTTGCAGGAAGT3腰果 下引物：5biotin-GCTGCCTCACCATTTGCTCTA3 探：S'ALD-asaaaaasACAGAAGGTGCCGCTGCCAGAA3 腰果Anao3基因上引物：5COCTCCTCCTTTCATCCTCAT3鸡 下引物：5biotinGTCATAGCGGAACCGTGGATA3 鸡线粒体DNA基因探针，5'ALD-anaaaaaaaCTATGAATCCGGGCCTC3上引物5'GCCATATACTCTCCTTGGTGACA3探，5′ALD-snmaaaCACAACTTTTATCACAATCCAGAACTGACACCAAC3 下游引物：5'biotinGTAGGCTTGGGAATAGTACGA3 牛线粒体DNA基因
