中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4525.3-2016
出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第3部分：副溶血性弧菌
Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export foodPart3:Vibrioparahemolyticus
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法》共分10个部分：
第1部分：沙门氏菌： 第2部分：金黄色葡萄球菌：第3部分：副溶血性弧菌：第4部分：霍乱弧菌；第5部分：克罗诺杆菌：第7部分：空肠弯曲菌： 第6部分：化脓链球菌；第8部分：致泻性大肠埃希氏菌：第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌：第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌.本部分为SN/T4525的第3部分. 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本部分起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局.
本部分主要起草人：曾静、付薄博、蒋原、薛峰、张琳.
MLST方法第3部分：副溶血性弧菌 出口食品中致病菌的分子分型
1范围
SN/T4525的本部分规定了出口食品中副溶血性弧菌分子分型MLST检测方法. 本部分适用于出口食品中副溶血性强菌的分子分型
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的. 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB4789.7食品安全国家标准食品生物学检验 副溶血性弧菌检验GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 GB19489实验室生物安全通用要求
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
3.1.1 下列术语和定文适用于本文件
细胞中均要表达的一 基因 式产 物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保守并且在大多数情况下持续表站.又称看家基因，持家基因.
3.1.2
Taq DNA苗Thermus aquarieus DNA polymerase
从Thermus aquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件.dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylene Dinmine Tetraacetic Acid)ML.ST：多位点序列分型（multilocus sequence typing）ST：序列型（Sequence Type） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]
4原理
MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编
SN/T 4525.3-2016
号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性.M1.ST分型中多个管家基因的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的实验室间具有良好的可比性.
5试剂和材料
除有特殊说明外，实验用试剂均为分析纯或生化试剂：实验用水符合GB/T6682中一级水的
要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.5.1DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒. 5.2TaqDNA酶5.3 dNTP;dATP、dTTP、dCTP、dGTP.5.4引物：扩增引物和测序引物序列见表A.25.510×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4）.200mmol/1.氯化钾，15mmol/L氯化镁.5.6琼脂糖凝胶. 5.7Gelred核酸染色剂.5.86×澳酚蓝上样缓冲液.5.9分子量标记：100 bp DNAmarker.5.105×TBE电泳缓冲液：445mmol/LTris，445mmol/1.硼酸，10mmol/L.EDTA（pH8.0）.使用时5.11质控菌株：副溶血性弧菌ATCC17802或等效菌株. 稀释为0.5XTBE电泳缓冲液.
6仪器和设备
6.2天平：量程2kg，感量0.1g 6.1离心机，6.3pH计.6.6电泳仪. 6.7凝胶成像仅.6.8基因测序仅.6.9超净工作台.6.10移液器：0.1μL~2.5μL、2pL~20L、20μL~200pL、100pL~1000pl
6.4涡旋振荡器，
6.5PCR仪.
7检测程序
根据副溶血性弧菌的7个管家基因，设计PCR引物和测序引物序列（见附录A），通过管家基因片段的PCR扩增.再进行PCR产物的纯化和DNA序列双向测定，将所得到的副溶血性弧菌7个管家基 因测序结果的上下游序列整合后得到完整序列，为减小误差首尾的几个碱基不计算入序列测定结果.最后将测序结果上传至MLST网站（http：//mlst warwick.ac.uk/mlst/）进行在线数据分析，得到的结果与M1.ST数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定副溶血性弧菌分离株的序列型.在确定ST基础上应用eBURST程序对菌株进行分析，构建系统遗传进化树（参见附录B）.
M1ST的操作程序见图1.
图1MLST操作程序
8检测步骤
8.1细菌基因组DNA提取
将经过GB4789.7的方法鉴定为副溶血性弧菌的菌株提取基因组DNA.
8.2MLST基因选择
按表A.1所示，选择副溶血性弧菌的7个管家基因进行MLST分析.
8.3PCR扩增引物和测序引物的选择
按表A.2中的序列，合成副溶血性弧菌7个管家基因对应的7对PCR扩增引物和7对测序引物.引物在使用前按照相应分子量进行稀释到10pmol/L，一20℃保存备用.
8.4管家基因片段的PCR扩增
反应体系体积为50pL:10×PCR缓冲液5pL、dNTP(2.5mmol/L)1pl、引物对（10μmol/L)1 pl、Taq DNA 聚合酶（5 U/αL)1 pL、模版 DNA 3 pL、水38 pxL
