中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4675.30-2017
出口葡萄酒中拜氏接合酵母检验 SYBRGreenI荧光PCR法
Determination of Zygosaccharomyces bailii from wine for export-SYBRGreenIPCRmethod
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4675《出口葡萄酒品质分析方法》共分为30个部分：第1部分：出口葡萄酒中甘油的测定酵法：第2部分：出口葡萄酒中2.3-丁二醇的测定气相色谱法：第3部分：出口葡萄酒中乙醇稳定碳同位素比值的测定： 第4部分：出口葡萄酒中乳酸的测定酵法；第5部分：出口葡萄酒中有机酸的测定离子色谐法：第6部分：出口葡萄酒中葡萄糖、果糖和蔗糖的测定：第7部分：出口葡萄酒中乙醛的测定气相色谱-质谱法；第8部分：出口葡萄酒中5-经甲基醛的测定液相色谱法： 第9部分：出口葡萄酒中二甘醇的测定气相色谱-质谱法；第10部分：出口葡萄酒中赭曲霉毒索A的测定液相色谱-质谱/质谱法：第11部分：出口葡萄酒中7种花色苷的测定超高效液相色谱法：第12部分：出口葡萄酒中溶菌酶的测定液相色谱法；第14部分：出口葡萄酒中纳他霉索的测定液相色谱-质谱/质谱法；第15部分：出口葡萄酒中水杨酸、脱氢乙酸、对氯苯甲酸的测定液相色谱法；第16部分：出口葡萄酒中富马酸的测定液相色谱-质谱/质谱法：第17部分：出口葡萄酒中丁基锡含量的测定气相色谱-质谱/质谱法： 第18部分：出口葡萄酒中二硫代氨基甲酸酯残留量的测定顶空气相色谱法：第19部分：出口葡萄酒中钠、镁、钾、钙、铬、锰、铁、钢、锌、砷、硒、银、偏、铅的测定：第20部分：出口葡萄酒中稀土元素的测定电感耦合等离子体质谱法：第21部分：出口葡萄酒中可溶性无机盐的测定离子色谱法：第22部分：出口葡萄酒中总二氧化硫的测定比色法： 第23部分：出口葡萄酒及葡萄汁中氨氮的测定连续流动分析仪法；第24部分：出口葡萄酒福林-肖卡指数的测定分光光度计法：第25部分：出口葡萄酒颜色的测定CIE1976（1ab）色空间法：第26部分：出口葡萄酒浊度的测定散射光法；第28部分：出口葡萄酒中细菌、霉菌及酵母的计数； 第27部分：出口葡萄酒碱性灰分的测定：第29部分：出口葡萄酒中酒香醇母检验实时荧光PCR法：第30部分：出口葡萄酒中拜氏接合醇母检验SYBRGreenI荧光PCR法，本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本部分为SN/T4675的第30部分本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口，局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局.
本部分起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫
张进杰、李学民、李志勇、刘青. 本部分主要起草人：钱云开、高飞、王海洋、王传现、王飞、肖艳霞、崔宗岩、李响、钟亚莉、葛娜、
出口葡萄酒中拜氏接合酵母检验 SYBRGreenI荧光PCR法
1范围
SN/T4675的本部分规定了萄酒中拜氏接合酵母（Zygosaccharomyces baili）的SYBRGreen1荧光PCR检验方法.
本部分适用于红葡萄酒、白葡萄酒和桃红葡萄酒中拜氏接合酵母的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1
拜氏接合酵母Zygosaccharomycesbailii
拜氏接合酵母属王酵母科（Saccharomycetaceae），接合酵母属（Zygosaccharomyces），营养细胞呈椭圆形，（3.5pm~6.5μm）×（4.5μm~11.5μm）.无运动，以多边出芽无性生殖为主；在25℃~30℃条件下，培养3d~7d在营养琼脂培养基上菌落光滑、圆形、呈奶油色或白色，菌落直径2mm~3mm.
4缩略谱
下列缩略语适用于本文件.
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate）CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniubromide） Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)OD值：光密度值（optical density）
5方法提要
采用SYBRGreenI荧光PCR法进行检验，通过加人反应体系中的SYBRGreenI荧光染料特异性地掺人新合成的DNA双链后，发射荧光信号，观察荧光PCR仪获取的扩增曲线，判断反应体系中是否存在特异的DNA靶标，从面对葡萄酒中的拜氏接合醇母进行快速检验.
6试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，实验用水采用GB/T6682规定的一级水.试剂均用无DNA酶的容器分装.
6.1引物：所用引物信息见表1，引物浓度10μmol/L，一20C保存备用.
表1PCR扩增所用引物核苷酸序列
扩增基园 引物名称 引物序列 产物大小（bp）26S核糖体 RNA基因 ZBF1 122ZBRI 5'-CGTCCGCCACGAAGTGGTAGA-
7仪器和设备
7.1荧光PCR仪.7.2磁力搅拌器. 7.3水浴锅或金属恒温加热器：5℃~100℃.7.4涡旋振荡器.7.6移液器及对应吸头：10μL、100pL、200μL、1000pL.
7.5离心机：12000×g.
8检测步骤
8.1样品前处理
无菌操作取两份样品，每份45mL置于无菌50mL离心管中，一份用于检验；一份于4℃条件下保存，作为留样.样品和对照组在4C，12000r/min，离心5min，弃上清；加人45mL10mmol/LTris2
SN/T4675.30--2017
1.5mL离心管中. HClpH8.0充分震荡：4℃，12000r/min，离心5min，弃上清液，轻微涡旋，将残留液体和沉淀转移至
8.2DNA提取
8.2.1在上述1.5mL离心管中加人600μL.山乘醇缓冲液和5pμL10U/μl.的溶细胞酶（Lyticase），涡旋振荡以充分混匀.30C保温30min.4℃.4000r/min离心10min，弃上清.
8.2.2加人700μL20g/L.CTAB裂解液，涡旋振荡器上震荡充分混匀，置于65C水浴中0.5h~2h.冷却至室温后，加人400μL酯：三氧甲烷：异戊醇（25：24：1），倒混匀，4C，12000r/min离心8min，转移上清至新离心管中，弃沉淀.向上清液中加人1/10体积的3mol/LpH5.2的乙酸钠.混匀.加人等体积的异丙醇轻轻颠倒混匀.置于-20C冰箱中.放置40min.4C.12000r/min离心8min，弃上清，保留沉淀，加人600L.70%乙醇轻轻颜倒儿次，4C.12000r/min离心1min，弃上 清，用干净的吸水纸吸干净残留液.将离心管静置至干燥.
8.2.3定容与含量测定：干燥后的离心管底部加人50LTE.置于65C水浴中保温40min，室温下测定DNA含量，用TE缓冲液调整DNA浓度为100ngμL，作为PCR工作液浓度，4C保存.模板DNA的提取也可以使用等效DNA提取试剂盒.
8.3实时荧光PCR扩增
每个样品做两个平行.实时荧光PCR采用25pl.体系：2XSYBRgreen1PCR预混液12.5pL，上下游引物各1pL，双蒸水8.5μl，DNA模板2pl
PCR反应参数为：95C，10min94C.15s.60C.1min.40个循环.熔解曲线分析参数：95℃，1s，65℃，15s持续升温（0.1℃/s）并检测荧光信号至95YC.1s.不同厂家型号的仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整.
9PCR质控
检测过程中设阳性对照、阴性对照和空白对照，拜氏接合酵母DNA模板作为阳性对照，酿酒醇母DNA模板作为阴性对照，以水为空白对照，与样品DNA同时进行PCR反应，基线调整取6个~15个循环的荧光信号，阔值设定原则以阔值线刚好超过阴性对照的检测荧光曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整，以超过3个~15个循环左右的茨光信号值标准偏差10倍为参考.
10结果判定
10.1质量控制
有效，结果应符合以下要求，有一项不符合者，应重复整个实验过程. 基本原则：在对结果进行最终判读前，应首先检查阴性和阳性对照结果以及熔解曲线，为保证试验
空白对照：无扩增曲线或者C：值≥40.0
阴性对照：无扩增曲线或者C：值≥40.0.
阳性对照：出现典型扩增曲线且Ct值≤35.0.
在82C～84C之间，扩增曲线有明显的指数增长特性 出现扩增信号的待检样品应检查熔解曲线，熔解曲线形态应与阳性对照一致，为单一波峰，Tm值
10.2结果判断
Ct值≤35.0，对照结果正常且熔解曲线正常者，报告检出可通过测序比对进行确证实验，序列参见
