中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T4810-2017
Determination of β-lactams residues of live animals for import and exportRadio-receptor assay method
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草. 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口.本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局.本标准主要起草人：孟日增、康明芹、宋屿竹、刘韬、刘金华、张旭光、曲辉、王嘉祺、石建平.
残留量的测定放射受体分析法 进出口食用动物内酰胺类药物
1范围
本标准规定了进出口食用动物血液和尿液中β内酰胺类抗生素残留的检测方法.
本标准适用于进出口食用活动物中B-内酰胺类6种抗生素（青霉素G、阿莫西林、氨苄青霉素、头孢霉素、头抱噻呋、邻氯青霉素）残留量的筛选检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
本方法的测定原理是药物功能团与微生物受体位点的结合反应，这些位点与某一类种抗生素的共有功能团相关，应用受体的这种特异性可以实现对某一类抗生素的多残留分析.当样品中含有3内酰 胺类抗生素时，样品中的P内酰胺类抗生素残留物与受体试剂中相应受体的结合位点结合，从面阻止了[C]标记的青霉素G与受体试剂位点结合，样品中3内酰胺类药物含量越高，竞争的结合位点越多，["C]标记的青霉素G结合的则越少，用液体闪烁计数仪测定样品中[“C]含量的cpm值（countper-minute，即每分钟脉冲数）越低，样品中3-内酰胺类抗生素残留量与cpm值成反比.
4试剂和材料
4.1β-内酰胺类抗生素Charm-Ⅱ测定试剂盒（MRLSequentialAssay）药片标识为P
4.2阴性对照样品：经证实不含β-内酰胺类抗生素的基质浓缩干粉，贮存2C~6C.
4.3MSU多抗生素浓缩标准品：含有青霉素G、阿莫西林、氨苄青霉素、头孢霉素、头孢噻味、邻氯青霉素等多种抗生素的标准品.使用时用10mL水溶解，充分摇匀，配成MSU多种抗生素标准溶液（其中青霉素G浓度为1000μg/kg）.
4.4MSU萃取缓冲液浓缩干粉：使用时用1000mL水溶解，可于2℃~6℃贮存2个月.
4.5M2缓冲液浓缩干粉：使用时取浓缩干粉用50mL水溶解，配制成M2缓冲液，可于2C~6C贮存2个月.
4.6闪烁液.
4.7硅确酸盐玻璃试管及试管塞.
4.8具塞塑料离心管：50ml.
SN/T 4810-2017
4.9水：符合GB/T6682二级水的规定.
5仪器和设备
5.3组织匀浆器.5.5涡旋混合器：可振荡与加热.
5.1液体闪烁计数仪：CharmI7600分析仪.
5.2分析天平：感量为0.1g和0.1mg.
5.4离心机：转速可达到2000g，
5.6微量移液器：20 μxL~100 μL，200 μL~1 000 μL、1 000μL~5 000μL.
5.7恒温加热器：65℃士2℃，35℃±1℃.
6分析步骤
6.1试样制备与保存
6.1.1试样制备
6.1.1.1尿液：新鲜澄清尿液可直接使用，若混浊应离心去除沉淀物，取上清.
6.1.1.2血液：全血凝固后取血清.
6.1.2试样保存
试样可于-18℃以下保存，新鲜样品可在2℃~6℃贮存24h
6.2检测方法
6.2.1对照液的配制
6.2.1.1阴性对照液的配制：取2mL阴性组织液，加入6mLMSU萃取缓冲溶液中混匀，制成阴性对 照液，该对照液可在室温下保存6h.
6.2.1.2阳性对照液的配制：取0.3mLMSU多种抗生素标准溶液-加人6mL阴性组织液中混匀，然后从中取2mL混合溶液加人到2mL.MSU萃取缓冲溶液中混匀制成25Pg/kg阳性对照液，该对照液可在室温下保存6h.
6.2.2试样提取
6.2.2.1取50mL清洁离心管，并标明标记.
6.2.2.2移取2.0mL尿液或者血清样品添加到50mL离心管内.加人30mLMSU萃取缓冲溶液到离心管，涡旋振荡5min.
6.2.2.3置80C±2C孵育器内孵育30min后置冰水内10min.
6.2.2.4于1750g离心10min后，吸出上清液恢复室温，用pH试纸条检查pH是否为7.5，如不准确则用M2缓冲液或0.1mol/L盐酸调整至pH7.5.即为样品测试液，
注：调节pH值所用溶液的体积应尽量小，以使对旅度的影响可以忽略不计.
6.2.3测定
6.2.3.1从试剂盒中取出试剂片，用试剂盒中所附压杆平端将受体药片推出到洁净试管中，用移液器取300μL水至样品试管中，用涡旋混合器混合10s将药片打碎.
6.2.3.2用移液器加人2mL样品待测液，或阴性对照液或阳性对照液到试管内.每一样品均使用新吸头.
孵育2min
6.2.3.4从孵育器上取下试管用药片压杆[”C]标记的青霉素G片剂，涡旋混合10s，上下来回颠倒10次，将试管置于55℃士1℃孵育2min
6.2.3.5取出试管，于1750g离心3min，离心停止后立即取出试管倒掉上清液，保持试管口向下倾斜用吸水材料清除试管内的颗粒物并吸干管壁内的残渍，不要接触沉淀物.
6.2.3.6加300pL蒸馏水到试管内，振荡并混合均匀后加人3mL闪烁液到试管内，将试管塞盖上后，涡旋混匀至试管内没有不均一的云状物，放人液体闪烁计数仪内，读[C]项的cpm值.
6.2.4控制点的确定
6.2.4.1控制点是判断样品阴性与初筛阳性的一个界定值，可根据筛选水平自行设定.对于同一批号的试剂，正常情况下只需测定一次控制点.
6.2.4.2筛选水平为25μg/kg时，控制点设定步骤为量取确证为阴性的尿液血清6.0mL样品，加人0.3mLMSU多种抗生素标准溶液，充分混匀吸取4mL.再加人4mLMSU缓冲液制成标准样品.测 定6个非重复的加标样品的cpm值，求出cpm平均值乘上系数1.2，即为筛选水平25μg/kg的控制点.
7结果判定
7.1当样品的cpm值大于控制点时，判定为阴性”.
7.2当样品的cpm值小于或等于控制点时，应重新测定样品，且同时需要测定阴性对照液和阳性对照液.当重新测定样品的cpm值大于控制点时，判定为“阴性”；小于或等于控制点时，则判定为“初筛阳性”.
8检测限
β-内酰胺类6种抗生素检测限见表1.
表1B-内酰胺类6种抗生素检测限
检测物 检测限 pR/kg青霉家G 25阿莫西林 50氨卡西林 50邻氯青霉素 300双氯青霉素 200头饱暖唤 150
