中华人民共和国出入境检验检疫行业标准
SN/T 4848.2-2017
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法第2部分：油菜
Identification of mon honey plant species in export honey-
Real-timePCRmethod-Part2:Canola
中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
SN/T4848（出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法实时荧光PCR法》共分为8个部分：
第1部分：荆条：第3部分：洋槐： 第2部分：油菜；第4部分：楼树；第5部分：般树：第6部分：龙眼：第7部分：荔枝和龙眼：
第8部分：紫云英.
本部分为SN/T4848的第2部分.
出口蜂蜜中常见蜜源植物成分的检测方法 实时荧光PCR法第2部分：油菜
1范围
SN/T4848的本部分规定了出口蜂蜜中油菜成分的实时荧光PCR检测方法.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和实验方
GB14963-2011食品安全国家标准蜂蜜GB/T27403-2018实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文
3.1
蜂蜜honey
蜜蜂采集植物的花蜜、分逐物或董露，与自身分泌物混合后，经充分酿造面成的天然甜物质.
油菜canola
实时荧光PCRreal timePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程，实现对起始模板的定量及定性分析.
3.4
Ct值cyele threshold
每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数.
4缩略语
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleic acid）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）
下列缩略语适用于本文件.
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonuleoside triphosphate）
SN/T 4848.2-2017
dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate）UNG：尿喀啶N-糖基化酶（uracil N-glycosylase） dTTP：脱氧胸廿三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）Tris：三羟甲基氨基甲烷[Tris（Hydroxymethyl）aminomethane]EDTA：乙二胺四乙酸（Ethylene diaminetetraacetic acid)Taq：水生栖热菌（Thermus aquaticus）OD：光度密度（opticaldensity） FAM：基荧光素（Carboxyfluorescein）TAMRA：基四甲基罗丹明（Carboxy-tetramethyl-rhodamine）BHQ1：黑洞猝灭基团1（Blackhole quencher 1)
5方法提要
提取样品DNA，以油菜来源DNA为阳性对照，以其它蜜源植物DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照，采用油菜的特异性引物和探针进行实时荧光PCR扩增，观察实时荧光PCR的增幅现象判定是否存在油菜成分.
6试剂和材料
除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂.实验用水符合GB/T6682的要求.试剂均用无DNA酶污染的容器分装.
6.1检测用引物和探针：油菜成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见表 1.油菜引物扩增的靶标序列参见附录A.
表1油菜基因扩增引物探针序列
物种名称 引物/探针序列（5'→3°） 扩增片段 靶基因长度F GCTGAAGCAGCTACTTTCGAAGTAACA 138 bp NADH dehydrogenase内参照 R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA P:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 subunit B( mdhB) geneF;GAGGATAACCCCGCACTAGC油菜 R:GGTGGGAGCCAAGAGACTTC 169 bp cryptochrome 2bP:FAM-TTTTCATTTGGTGCCCTGAAGAAGAAGG-TAMRA (cytb)gene
6.3异丙醇. 6.2三氯甲烷（氯仿）.6.4体积分数为70%的乙醇.6.5NaCl溶液（1.2mol/L).6.6蛋白酶K（20mg/mL).
6.7CTAB 提取缓冲液：20 g/L CTAB 1.4 mol/L NaCl.0.1 mol/L Tris-HCl.0.02mol/L NaEDTA.pH 8.0.6.8CTAB沉淀液：5g/LCTAB.40 mmol/L NaCl6.910×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH 8.4） 200mmol/1.KCl.15mmol/LMgCl.6.10实时荧光PCR反应混合液：12.5pL反应体系包括：1U~2U（Umit，酶学单位）的Tag酶、1× PCR buffer、2.5 mmol/1~4.0 mmol/L. 的 Mg²*、0.2 U~1 U的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A.C G)TPs、0.2mmol/L~0.4mmol/LdUTP、400nmol/LROX染料（某些荧光PCR仅无需ROX校正）.
7仪器设备
7.1实时荧光PCR仪.7.2核酸蛋白分析仪或紫外分光光度针.7.3恒温水浴锅.7.5微量移液器：0.5μl~10gL.10μL~100pL 20μL~200μL 200μL~1000μl 7.6恒温混匀仪.7.7涡旋震荡器.7.8pH计.7.9量筒：容量50ml. 7.10烘箱.
7.4离心机：离心力≥12000g.
8检测步骤
8.1DNA提取
8.1.1蜂蜜沉淀DNA提取
8.1.1.2取20mL蜂蜜样品，分成2管，每管10mL于50mL离心管中，加人无菌双蒸水至30mL，涡8.1.1.3沉淀部分用1mL无菌水洗脱，分装于2mL离心管中.12000r/min离心5min，去除上清. 旋混匀，4000r/min离心10min，吸出上清（4C贮存备用）.8.1.1.4加人600pLCTAB提取缓冲液，置于65C恒温混匀仪中温育1h~2h，转速为650r/min；12 000r/min离心 10 min 8.1.1.5转移上层清液至2mL离心管中：加人0.7倍体积的三氯甲烷，剧烈震荡混匀，室温下12000r/min 离心10 min.8.1.1.6加人等体积CTAB沉淀液混匀，13000r/min离心10min.8.1.1.7弃上清，加上350μL1.2mol/LNaCl溶液，充分溶液沉淀.8.1.1.8加人0.8倍体积的异丙醇混匀，-20C放置0.5h~1h，12000r/min转速4C离心10min~15 min. 8.1.1.9弃上清，用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000r/min转速下4C离心10min.8.1.1.10弃上清，室温下晾干.加人50pL~100pL双蒸水，溶解沉淀，-20C保存.
8.1.2蜂蜜上清DNA提取
将上清分装到2个50mL离心管中，每管20mL.参照附录B步骤进行核酸DNA提取，DNA存放
