中华人民共和国国家标准
Diagnosis of infectious haematopoietic necrosis
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准代替GB/T15805.2-2008《鱼类检疫方法第2部分：传染性造血器官坏死病毒（1HNV）》.本标准与GB/T15805.2-2008相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：
修改了标准名称；增加了缩略语（见第3章）；删除了PCR扩增IHNV 786bp、套式PCR扩增1HNV323bp方法（见2008年版3.7）：一增加了酶联免疫吸附试验（见8.3）； 增加了扩增IHNV693bp的方法（见4.10）：增加了间接免疫荧光抗体试验（见8.4）：增加了综合判定（见第9章）；增加了传染性造血器官坏死病（IHN）（见附录C）.
本标准由中华人民共和国农业部提出.
本标准由全国水产标准化技术委员会（SAC/TC156）归口.
本标准起草单位：浙江省宁波市海洋与渔业研究院、深圳市检验检疫科学研究院、全国水产技术推广总站、北京出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：王建平、沈伟良、高隆英、张利峰、吴雄飞、江育林、陈爱平、乐韵.
本标准代替GB/T15805.2-2008.
本标准所代替标准历次版本发布情况为：
GB/T 15805.11995;-GB/T 15805.2-2008
传染性造血器官坏死病诊断规程
1范围
本标准规定了传染性造血器官坏死病毒经细胞分离培养后通过逆转录聚合酶链式反应、酶联免疫吸附试验和间接免疫荧光抗体试验鉴定的方法.
本标准适用于传染性造血器官坏死病的流行病学调查、诊断、检疫和疫情监测.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件.CPE：细胞病变效应（cytopathiceffect）ELISA：酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay）FCS:胎牛m清(fetal calf serum)FHM:胖头鳞肌肉细胞系（fathead monnowcell line)G蛋白：糖蛋白（glycoprotein） HEPES;4-羟乙 基喂嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic acid]IFAT：间接免疫荧光抗体试验（indirect immunofluorescent antibody test）IHN：传染性造血器官坏死病（infectious haematopoietic necrosis)IHNV：传染性造血器官坏死病毒（infectious haematopoietic necrosis virus) RT-PCR：逆转录-聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction)PBS：磷酸缓冲盐溶液（Phosphate Buffer Saline)PBST：磷酸缓冲盐吐温溶液（Phosphate Buffer Salin-Tween)PCR：聚合醇链式反应（Polymerase Chain Reaction）FITC：异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）
EPC：鲤上皮瘤细胞系（epithelioma papulosum cyprini cell line)
4试剂和材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂.4.1水：GB/T6682中一级水，核酸抽提和RT-PCR应使用无RNA酶的去离子水. 4.2IHNV参考株：由国家主管部门指定机构提供.
4.3鱼类细胞系：EPC、FHM.4.4细胞生长液：用Earle's平衡盐的M199培养基配制，另加10%胎牛血清（FCS）.4.5细胞维持液：用Earle's平衡盐的M199培养基配制，另加2%FCS.4.6细胞消化液：见A.1.4.7HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸）. 4.8Taq酶：一20C保存，避免反复冻融或湿度剧烈变化.4.9dNTP: 含 dCTP dGTP dATP、dTTP各 10 mmol/L.4.10引物：依据1HNV糖蛋白（G蛋白）基因片段序列设计引物，扩增其中693bp片段（参见附录B）.正向引I物 F1：5'-AGA-GAT-CCC-TAC-ACC-AGA-GAC-3'; 反向引物R2：5'-GGT-GGT-GTT-GTT-TCC-GTG-CAA-3'4.11无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃.4.12AMV逆转录酵：一20C保存，避免反复冻融或温度剧烈变化.4.13RNA酶抑制剂：一20C保存，避免反复冻融或温度剧烈变化.4.14逆转录酶缓冲液和Tag酶缓冲液：分别见A.2、A.3. 4.15DNA分子量标准（DNA Marker）.4.16琼脂糖.4.17TBE电泳缓冲液：见A.4.4.18包被稀释液：0.02mol/L、pH=9.6的碳酸盐缓冲液（见A.5）.4.19羊抗IHNV免疫球蛋白（lg）：由动物防疫管理部门指定单位提供. 4.20鼠抗IHNV的单克隆抗体：由动物防疫管理部门指定单位提供.4.21辣根过氧化物酶标记的抗鼠抗体.4.22封闭液.4.24FITC标记的抗鼠抗体.4.25样品缓冲液：见A.6. 4.26氯化镁溶液：见A.7.
5器材和设备
5.124孔、96孔细胞培养板、细胞培养瓶.5.2倒置荧光显微镜.5.3恒温培养箱.5.4冰箱.5.5微量可调移液器及吸头. 5.6离心机和离心管.5.7PCR扩增仪.5.8水平电泳仪.5.9紫外透射仪或凝胶成像仪.5.11水浴锅. 5.10高压灭菌锅.5.12制冰机.5.13磁力搅拌器.5.14培养液过滤器. 5.15酵标仪.2
6临床症状
临床症状见附录C.
7样品采集及处理
7.1样品采集
7.1.1产地采样
应在水温低于18C进行，采样数量应符合SC/T7103的要求.
7.1.2采样对象
鲜、鲜等易感鱼类.
7.1.3样品采样
按GB/T18088的规定执行，对有临床症状的鱼，体长≤4cm的鱼苗取整条，若是带卵黄囊的鱼应去掉卵黄囊；体长4cm~6cm的鱼取内脏（包括肾）；体长大于6cm的鱼则取肝、肾和脾.对无症状的鱼取肝、肾、脾；亲鱼取卵巢液和精液；鱼卵则取卵膜.
7.2样品保藏及运送
样品需采集活的易感鱼类，并尽可能采集带有疾病症状的易感鱼.运送过程需充氧以保持鱼类的存活，尽快送到实验室；取鱼组织需在4C下冷藏24h内送达实验室.
8病毒分离和鉴定
8.1病毒分离培养
8.1.1样品处理
IHNV的分离，每5尾鱼为1个样品，若有症状成鱼每1尾为1个样品.先用组织研磨器将样品匀浆成棚状，用含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的细胞培养液1：10稀释，混匀悬浮.于15C下孵育2h~4h或4℃下孵育6h~24h.12000g4℃离心15min，收集上清液.
8.1.2病毒分离
接种好的细胞板置于15C士2C培养7d.接种的细胞板需设2孔阳性对照（接种IHNV参考株的细胞）和2孔空白对照（未接种病毒的细胞）.
阳性对照和待测样品都接种细胞后.7d内每天用40倍、100倍倒置显微镜检查.空白对照细胞应正常，阳性对照细胞应出现CPE.如接种被检匀浆上清稀释液的细胞培养中出现细胞病变（CPE），立即进行IHNV的鉴定.无CPE出现时，在培养7d后应进行官传.传代时，将接种了组织匀浆上清稀24h之内培养的单层细胞中，再培养7d.继续倒置显微镜检查. 释液的单层细胞培养物冻融1次，收集并以12000g，4C离心15min，收集上清液，将上清液接种于
