中华人民共和国国家标准
GB/T19495.4-2018 代替GB/T19495.42004
转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR） 检测方法
Detection of genetically modified organisms and derived products-Qualitative real-time polymerase chain reaction(PCR）methods
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
GB/T19495《转基因产品检测》分为如下儿部分：
GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求；GB/T19495.4转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法； GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法：GB/T19495.5转基因产品检测实时荧光定量聚合酶链式反应（PCR）检测方法；GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法：GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法： -GB/T19495.8转基因产品检测蛋白质检测方法：GB/T19495.9转基因产品检测植物产品液相芯片检测方法.
本部分为GB/T19495的第4部分.
本部分按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
2004相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： 本部分代替GB/T19495.4-2004（转基因产品检测核酸定性PCR检测方法》，与GB/T19495.4-
一增加了植物内源基因的检测方法；增加了转基因植物筛选基因的检测方法；的品系特异性检测方法.
删除了结构基因检测方法，增加了大豆、玉米、油菜籽、棉花、水稻、马铃薯、亚麻和甜菜等作物
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本部分由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本部分主要起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境 检验检疫局.
本部分主要起草人：黄新、高宏伟、李想、凌杏园、朱水芳、陈洪俊、潘良文、曹际娟、章桂明.
本部分所代替标准的历次版本发布情况为：
GB/T 19495.4-2004
转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR） 检测方法
1范围
GB/T19495的本部分规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选和品系检测实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法有关的仪器设备、试剂和材料、检测步骤、质量控制、防污染措施以及方法的最低检出限.
本部分适用于大豆、玉米、油菜、水稻、棉花、马铃薯、亚麻、甜菜、首稽、番茄、木瓜、苹果、菊苣、剪股颖、烟草、李子、甜瓜、小麦、茄子和桉树等植物转基因筛选检测，也适用于大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、马铃薯、亚麻、甜菜和木瓜等植物的品系特异性检测.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1.1
转基因transtene
转录或表达，以便使该物种获得新的品种特征的技术.
3.1.2
实时荧光PCRreal-time polymerase chain reaction
实时荧光聚合酶链式反应.在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，并通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.
注：获光信号的强弱直接反映模板数量.
3.1.3
内源基因endogenous gene
在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因.
注：该基因可用于判定物种特异性.
3.1.4
外源基因exogenous gene
利用生物工程技术转人的其他生物基因.
注：转入外源基因后，该生物品种表现新的生物学性状.
3.1.5
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的闺值时所经历的循环数.
3.2缩略语
Alfalfa-Acc:首榕乙酰辅酶a 般化酶(Alfalfa Acetyl-CoA carboxylase) 下列缩略语适用于本文件.BAR：磷化麦黄酮乙酰转移酶基因（phosphinothricin acetyltransferase gene)bp ：碱基对(base pair)strain CP4 Product herbicide tolerant form of 5-enolpyruvulshikimate-3-phosphate synthase) CP4-EPSPS：农根菌 CP4蛋白基因和 5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（Agrobacterium tumefaciensCry IA（c)：苏云晶芽孢杆菌杀虫蛋白Cry IA（c）基因[Bacillus thuringiensis（Bt）subsp.Kurstaki crystal protein I A(c)]Cry3A：苏云晶芽孢杆菌杀虫蛋白Cry3A基因[Bacillus thuringiensis（Bt） subsp.Tenebrioniscrystal protein 3A] CTAB：十六烷基三甲基澳化铵（cetyltrithylammoniumbromide）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate)dGTP：脱氧鸟书三磷酸（deoxyguanosine triphosphate） dNTP：脱氧核书三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate)dUTP：脱氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate）EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid)EPSPS;5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因（5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase gene) GAG56:一种醇溶蛋白基因（one of Y-gliadin genes)GLuA3:大米谷蛋白基因（rice glutelin gene）GOX：草甘腾氧化还原酶基因（glyphosate oxidoreductase gene)LAT52：花粉特异蛋白LAT52基因Lectin：植物凝集素基因 NPT II：新霉素-3'-磷酸转移酶基因（neomycin-3-phosphotransferase gene)PAT：草丁腾乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyltransferase gene)PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）PM1:6-磷酸甘露糖异构酶基因（phosphomannose-isomerase gene） PLD:磷脂酶 D家族基因（phospholipase D family gene)pCaMV 35S：花椰菜花叶病毒35S启动子（35S promoter from caulilower mosaic virus)pFMV 35S:玄参花叶病毒35S启动子（35S promoter from a modified figwort mosaic virus)pNOS：来源于农杆菌的脂碱合成酶基因启动子（promoter of nopaline synthase gene fromAgrobacterium tumefaciens)
pTA29：来源于烟草的花蕊特异性TA29基因的发育调节启动子（developmentally regulatedpromoter from anther-specific TA29 gene from Nicotiana tabacum)pUbi:玉米泛素基因的启动子（promoter of maize Ubiquitin)SAH7:类拟兰芥属同源序列7的棉花内源基因（sinapis arabidopsis homolog7gene）SPS：蔗糖磷酸盐合成酶基因（sucrose phosphate synthase gene) SDS：十二烷基磺酸钠（sodium dodecylsulfate)Taq:DNA 聚合酶(Taq DNA polymerase)TE：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、乙二胺四乙酸二钠缓冲液（Tris-HC1、EDTAbuffer）E9：为来源于豌豆二磷酸核酮糖化酶基因的终止子 Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris（hydroxymethyl）aminomethane]tg7：谷氨酰胺转移酶7基因（transglutaminase 7gene)tNOS：来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因终止子（terminator of nopaline synthase gene fromAgrobacterium tumefaciens) tOCS：章鱼碱合成酶终止子（terminator ofoetopine synthase）t35S：花椰菜花叶病毒终止子（Caaliflower mosaicvirus 35 teminator）UDG:尿嘧啶 DNA-糖基酶（uracil DNA glycosylase)Solanum ruberosum) UGPase:马铃薯 UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因（UDP-glucose pyrophosphorylase gene fromUNG酶：尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase)Wx012:小麦蜡质基因(waxy wheat genes)zSS II b:玉米淀粉合成酶 b 亚基[the endosperm-specific SS(starch synthase)I b] 18SrRNA：真核生物核糖体小亚基18S 基因（18S ribosomal RNA)
4方法原理
结果，判断该样品中是否含有转基因成分.对外源基因检测结果为阳性的样品，或已知为转基因阳性的 提取样品DNA后通过实时荧光PCR技术对样品DNA进行筛选检测，根据实时荧光PCR扩增样品，如需进一步进行品系鉴定，则对品系特异性片段进行实时荧光PCR检测，根据结果判定该样品中含有哪（些）种转基因品系成分.
5仪器设备和试剂
5.1仪器设备
5.1.1实时荧光PCR仪.5.1.3天平：感量0.01g. 5.1.2样品粉碎仪或研磨机.5.1.4水浴锅或恒温孵育器.5.1.5冷冻离心机.5.1.6高压灭菌锅. 5.1.7涡旋振荡器.5.1.8生物安全柜.5.1.9pH计.5.1.11微量移液器(2pL、10μL、100pL、200μl、1000pL). 5.1.10核酸蛋白分析仅或紫外分光光度计.
