中华人民共和国国家标准
GB/T20753-2006
牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮 和醋酸甲地孕酮残留量的测定 液相色谱-紫外检测法
Method for the determination of melengestrol acetate chlormadinoneacetate and megestrol acetate residues in bovine and porcine fatLC-UVDetection Method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A和附录B为资料性附录.本标准由中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局提出. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局归口.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出入境检验检疫局.本标准主要起草人：庞国芳、唐毅锋、方晓明、王传现、姜维.
本标准系首次发布的国家标准.
牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮 和醋酸甲地孕酮残留量的测定 液相色谱-紫外检测法
1范围
本标准规定了牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的液相色谱测定方法.
本标准适用于牛和猪脂肪中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮残留量的测定.
本标准的方法检出限：醋酸关仑孕酮、醋酸甲地孕酮和醋酸氯地孕酮均为0.010mg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 12004 ISO 5725-1:1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004 ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
3原理
脂肪样品经微波融化，用乙晴提取，皂化后，经氰丙基型固相萃取柱净化，C：色谱柱分离，紫外检测，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.2甲醇：色谱纯. 4.1乙晴：色谱纯.4.3乙酸乙酯：色谱纯.4.4正已烷：色谱纯，4.5氯化镁（MgCl6H;O).4.6氢氧化钠. 4.7盐酸，4.8乙酸乙酯正已烷（I19）：量取10mL乙酸乙酯（4.3）与190mL正己烷（4.4）混合.4.9乙酸乙酯正已烷（I4）：量取40mL乙酸乙酯（4.3）与160mL正已烷（4.4）混合.4.11氯化镁溶液：1.0mol/L.称取20.3g氯化镁（4.5），用水溶解并定容到100mL. 4.10盐酸溶液：0.2%.移取2.0mL盐酸（4.7）与水混合至1L.4.12氢氧化钠溶液：0.1mol/L.称取1.00g氢氧化钠（4.6），用水溶解并定容到250mL.4.13乙晴水（6535）：量取650mL乙晴（4.1）与350mL水混合，摇匀，脱气，待用.
GB/T 20753-2006
4.14标准物质：醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮，纯度≥97%.4.15标准储备溶液：1000μg/mL.准确称取醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和酯酸甲地孕酮（4.14）标准物质各0.0500g于50mL容量瓶中，用甲醇（4.2）溶解并定容至刻度.标准储备溶液于4C保存，可 使用1年.4.16混合标准溶液I：100ug/mL.分别吸取10.0mL醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕酮标准储备液（4.15）于100mL容量瓶中，用甲醇定容.该混合标准溶液于4C保存，可使用1年.4.17混合标准溶液Ⅱ：1.0μg/mL.取1.0mL混合标准溶液1（4.16）于100mL容量瓶中，用甲醇定4.18混合标准工作溶液：分别吸取10μL 20μL 40pL 80yuL，100μL混合标准溶液Ⅱ（4.17）添加到 容，该混合标准溶液于4C保存，可使用6个月.980 pL，970μL，950μL，910pL，890L的乙水（6535）（4.13）中，再加人10L盐酸溶液（4.10），混匀，得到浓度为 0.010 μg/mL.0 020 μg/mL、0.040 μg/mL、0.080 μg/mL 和 0.10μg/mL混合标准工作溶液，该溶液当日制备.洗，保持柱体湿润.4.20膜：0.2 yum.
5仪器
5.1高效液相色诺仪：配有紫外检测器.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3氮气浓缩仪.5.4固相萃取装置：配有真空泵.5.5低温离心机：-5C至室温，最大转速5000r/min. 5.6液体混匀器.5.7恒温水浴.5.8微波炉.0001~00T001~06
6试样的制备与保存
6.1试样制备
把大约5g的猪或牛脂肪组织切成小块，然后放入底部塞有玻璃棉的漏斗中，将漏斗放入150mL的烧杯中，将烧杯置于微波炉内.使用最大功率，加热30s~60s，如果脂肪没有融化，可在间隔30s~ 60s以后重复加热30s~60s，直到有液体脂肪流出，通过漏斗滴入烧杯中.根据需要熬制的脂肪量，可重复加热，把熬制好的脂肪油故人样品瓶中，密封，并做上标记.
6.2试样保存
如果熬制好的脂肪液体不立刻测定，则将熬制好的脂肪样品置于一18C冰柜中，冷冻保存.
7测定步骤
7.1提取
称取2g脂肪样品，精确到0.01g，置于50mL具塞离心管中，加人5mL乙精，于60C水浴中保持3min，使固体脂肪融化.用液体混匀器（5.6）涡族1min，于一5C以3.500r/min离心7min，吸取上清液至15mL具塞聚丙烯离心管中，再向沉淀物中加人5mL乙晴重复提取一次，合并上清液.向合并的 乙提取液中加人2mL正已烷，涡旋1min，于一5C以3500r/min离心5min，弃去正已烷层，乙晴相再用2mL正已烷重复洗涤一次，弃去正已烷层.乙晴提取液于60C用氮气浓缩仪吹干.
7.2皂化
向乙晴提取液（7.1）中依次加人4mL正已烷、1mL氢氧化钠溶液（4.12）和0.5mL氯化镁溶液（4.11），于液体混匀器上快速混匀10s，在60C水浴中保持15min，于一5C以3500r/min离心5min， 吸取上清液至15mL玻璃离心管中.向沉淀物中再加人4mL正已烷，混匀，于60C水浴中加热15min后，于一5C以3500r/min离心5min，合并上清液.于60C用氮气浓缩仪吹干，用1.0mL正已烷溶解残渣，待净化.
7.3净化
移人固相萃取柱中.待样液流出后，依次用5mL正已烷和6mL乙酸乙酯正已烷溶液（4.8）淋洗固 将上述样液（7.2）移入氰丙基固相萃取柱中（4.19），用2mL正已烷分两次润洗玻璃试管，洗液也相萃取柱，淋洗液流出后，固相萃取柱抽干2min，最后用3.5mL乙酸乙酯正已烷溶液（4.9）洗脱，洗脱液收集于另一15mL玻璃离心管中，于60C用氮气浓缩仪吹干.残余物用990aL乙晴水（4.13）涡旋溶解，静止15min后，加人10pL盐酸溶液（4.10），混匀，过0.2ym滤膜后，供液相色谱测定.
7.4测定
7.4.1液相色谱条件
a）色谱柱：KromasilC5m，250mm×4.6mm（内径）或相当者；b）预柱：C，5μm，12.5mm×4.6mm（内径）；d）流速：1.0mL/min; c）流动相：乙晴水（6535）；f）检测波长：292nm；g）进样量：40L.
7.4.2液相色谱测定
用混合标准工作溶液（4.18）分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线.用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中醋酸美仑孕酮、醋酸氯地孕酮和醋酸甲地孕地孕酮标准物质的液相色谱图参见图A.1.
7.5平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定.
7.6回收率试验
阴性样品中添加标准溶液，按7.1~7.3操作，测定后计算样品添加的回收率.
8结果计算
结果按式（1)计算：
.(1)
式中：
X-试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）；（一从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为微克每毫升（ug/mL）；V-一试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）；m-最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克（g）.
9精密度
本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，重复性和再现性的值
