中华人民共和国国家标准
GB/T 21107-2007
Identification of horse and donkey derived materials in animal-originatedfeedstuffs-PCRmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出.本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国青岛出入境检验检疫局.本标准主要起草人：宗卉、曾少灵、温燕辉、徐宝梁、高宏伟、陈颖、吴亚君、郑秋月、曹际娟.
本标准首次发布.
动物源性饲料中马、驴源性成分 定性检测方法PCR方法
1范围
本标准规定了动物源性饲料中马、驴（Equoidea）源性成分检测的PCR方法，该检测方法的检出限为0.1%（质量分数）.
本标准适用于动物源性饲料中马、驴源性成分的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T 14699.1阿料采样(GB/T 14699.1-2005.1SO 6497:2002IDT)
SN/T1193基因检验实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准.
3. 1
聚合酶链式反应polymerase chainreaction：PCR
用于扩增位于两段已知序列之间DNA（deoxyribonucleosidea acid.脱氧核糖核酸）的方法.模板别与模板DNA两条链上的一段互补序列发生退火，接着在DNA聚合酵的催化下以4种dNTP DNA经过高温变性成单链，在DNA聚合酶和适宜的温度下，两条互不互补的赛核苷酸片段即引物分（deoxyribonucleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸）为底物，使退火引物得以延伸，如此反复变性、退火和DNA合成这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增，经25个～30个扩增循环，扩增倍数达到约10°.
4原理
利用裂解液破碎细胞，三氯甲烷抽提蛋白质，异丙醇沉淀得到DNA：以提取的DNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物：应用限制性内切酶酶切反应进行确证.
5试剂和材料
除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB6682的要求.
5.1马、驴源性成分检测用引物（对）序列为：5′'tgccacagttggatacatcae 35'attgagattaggcgattgtt 35.2Taq DNA聚合酶（Thermusaquatica、水生栖热菌）. 5.3限制性内切酶：Saa3A酶，A/uI酶. upxop）.p(q ausoapxopps.NP
phate，脱氧胸苷三磷酸）、dCTP（deoxycytidine triphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dGTP(deoxyguanosinetriphosphate，脱氧鸟昔三磷酸）.5.6澳化乙锭. 5.5琼脂糖：电泳纯.5.7三氯甲烷.5.8异丙醇.5.970%乙醇.5.11裂解液：1%CTAB（cetyltrithylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵）.0.05 mol/LTris 5.10分子量标准品（100 bp~2000 bp)（bp:base pair，碱基对）.HCl(pH8 0）[Tris：tris（hydroxymethy1）aminomethane，三（羟甲基）氨基甲烷]0. 7 mol/LNaCl 0 01 mol/L EDTA (pH8 0)(ethylene diaminetetraacetic acid 乙 二胺四乙酸).5.12TE缓冲液（Tris-HCI EDTA 缓冲液）； 10 mmol/L Tris-HC1 （pH8. 0)，1 mmol/L EDTA5. 13 10 ×PCR 缓冲液 :100 mmol/1L KC1 160 mmol/L (NH);SO 20 mmol/L MgSO 200 mmol/L (pH8.0).Tris-HCl（pH8. 8)，1%Triton X-100(t-octylphenoxypolyethoxyethanol 辛基苯氧基聚乙氧乙醇），1 mg/mL BSA (bovine serum albumin 牛血 清蛋白).5.14电泳缓冲液：Tris54 g，硼酸27.5 g，0.5 mol/1. TE缓冲液（pH8.0)20 mL，加蒸馏水至1 000 mL：使 用时10倍稀释.5.15澳化乙锭贮存液：10mg/mL水溶液.5.16加样缓冲液：0.25%澳酚蓝：40%（质量浓度）蔗糖.5. 17 醇切缓冲液:10 mmol/ L Tris-HCI (pH7 5) 10 mmol/L MgCl; 50 mmol/ L NaCl 0. 1 mg/mL BSA.
6仪器设备
6.1DNA热循环仪.6.2离心机（离心力12000g）.6.3核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计. 6.4微量移液器（0.1pL~2pL，0.5μL~10μL，2μL~20yL，10l~100pL，20μL~200pL，200 μL~1 000 μL) 6.5电泳仪.6.6紫外检测仪.6.7pH计. 6.8恒温水浴锅.6.9天平（感量0.01g）.
7试样选取与制备
按照GB/T14699.1采样，将实验室样品粉碎，充分混合均匀后待用.
8检验步骤
8.1样品的总DNA提取
心管中，加人600μL~800μL裂解液，65C30min.期间不时振荡混匀；12000g离心5min；转移上清于洁净离心管中，加400L三氯甲烷异戌醇（241），混匀；12000g离心5min，取上清液；加0.8倍体积异丙醇，沉淀；12000g离心5min，弃上清液；70%乙醇洗涤一次，晾干；加人50gLTE，溶解沉淀.2
GB/T 21107-2007
也可用等效DNA提取试剂盒提取模板DNA
8.2DNA浓度和纯度的测定
或紫外分光光度计检测260nm和280nm处的吸光值A和Az.DNA的浓度按式（1)计算： 取5gLDNA溶液，用ddH;O（double distilledwater，双蒸水）稀释至1mL，使用核酸蛋白分析仪
c = A × N × 50/1 000
式中：
DNA浓度，单位为微克每微升（μg/pL）；
A-260nm处的吸光值；
N核酸稀释倍数.
当A/A比值为1.7~1.9之间时，适宜于PCR扩增.
8.3PCR扩增
HPP（VNqVN（/）N
反应条件：PCR反应条件随仪器不同略有改变.94C预变性1min~3min，94C变性30s~60s，57C退火30s~60s.72C延伸30s~-60s30个循环.72C延伸5min.4C保存.
检测过程中分别设阳性对照、阴性对照和空白对照.用已知含马或驴源性成分的样品作阳性对照，用已知不含马和驴源性成分的样品作阴性对照，用等体积的ddH：O代替模板DNA作空白对照.
8.4PCR扩增产物电泳检测
取2.0g琼脂糖，于100mL电泳缓冲液中加热，充分熔化，加人溴化乙锭贮存液至终浓度为0.5μg/mL，制胶.在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶.将5gL~8LPCR扩增产物下观察电泳结果并记录.
8.5限制性内切酶酶切及产物电泳检测
PCR扩增产物电沫检测结果阳性进行限制性内切酶酶切反应.
反应体系（50μL）:Sa3A酶1L（10U/uL），酵切缓冲液5pL，PCR扩增产物20L，ddHO24pl.充分混匀反应液，37C水浴1h，65C水浴5min终止酶切反应.酶切完成后电泳，方法见8.4.
9结果判断与表述
9.1PCR扩增产物电泳检测结果
马和驴源性成分的PCR扩增产物大小均为294bp（序列参考附录A）.
9.2限制性内切酶酶切电泳检测结果
马源性成分的PCR扩增产物经Saa3A限制性内切酶酶切后，片段大小为226bp和68bp.驴源性成分的PCR扩增产物经AlaI限制性内切酶酶切后，片段大小为113bp和181bp.
9.3结果表述
PCR扩增产物电泳检测结果阴性者判为不含有马、驴源性成分，表述为未检出马、驴源性成分.分，表述为检出马或驴源性成分. PCR扩增产物电泳检测结果阳性限制性内切酶酶切产物片段大小正确，判为含有马或驴源性成
10检测过程中防止交叉污染的措施
按照SN/T 1193执行.
11废弃物处理
检测过程中的废弃物，收集后在焚烧炉中焚烧处理.
