中华人民共和国国家标准
GB/T21164-2007
Liquid chromatography method
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.
本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中国兽医药品监察所.本标准主要起草人：陈惠兰、吴斌、赵增运、沈崇钰、丁涛、黄娟、朱成品、徐锦忠、蒋原、陶宏锦、朱馨乐.
蜂王浆中链霉素、双氢链霉素残留量测定 液相色谱法
1范围
本标准规定了蜂王浆中链霉素和双氢链霉素残留的液相色谱-柱后衍生化荧光测定方法.本标准适用于蜂王浆中链霉素和双氢链霉素残留量的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T 6682-1992neqISO3696：1987)
3方法提要
蜂王浆样品中链霉素和双氢链霉素用庚烷磺酸钠-磷酸钠混合提取液提取，提取液用C固相萃取柱净化，甲醇洗脱，旋转蒸发至干，用0.01mol/L庚烷磺酸钠溶液溶解定容，样品溶液经高效液相色谱-柱后衍生荧光检测器检测，外标法定量.
4试剂和材料
4.1甲醇：色谱纯.4.2水：应符合GB/T6682规定的一级水.4.3乙睛：色谱纯. 4.4氢氧化钠：分析纯.4.5三氯甲烷：分析纯.4.61.2-茶醒-4-磺酸钠：色谱纯.4.7叔丁基甲基醚：色谱纯.4.8正已烷：分析纯. 4.9庚烷磺酸钠：色谱纯.4.10磷酸钠：分析纯.4.11磷酸：分析纯.4.12链霉素和双氢链霉素标准物质：纯度≥99%.4.13C固相萃取柱：500mg.3mL.使用前用5mL甲醇10mL水预洗并保持柱体湿润. 4.14庚烷磺酸钠-磷酸钠混合提取液：称取10.10g庚烷磺酸钠、4.10g磷酸钠，溶于1000mL水中，用磷酸（4.11)调溶液pH3.3.4.15叔丁基甲基醚-正已烷溶液：取10mL正已烷、40mL叔丁基甲基醚，混匀.4.16庚烷磺酸钠溶液：0.01mol/L.称取2.02g庚烷磺酸钠，溶于1000mL水中，用磷酸（4.11）调4.17氢氧化钠溶液：0.2mol/L.称取8g氢氧化钠（4.4），溶于1000mL水中，过0.45μm的滤膜， pH3.3 抽滤脱气.
GB/T 211642007
4.181 2-茶醒-4-磺酸钠溶液：0.6mmol/L.称取0.078g1，2-茶醒-4-磺酸钠（4.6），用500ml水溶解，过0.45μm的滤膜，抽滤脱气.4.19链霉素和双氢链霉素标准储备溶液：0.10mg/mL.准确称取适量的链霉素和双氢链霉素标准 品，用水溶解定容，配制成0.10mg/mL的标准储备液.储备液贮存在4C冰箱中，保存期一年.4.20链霉素和双氢链霉素标准工作溶液：根据试验需要，用庚烷磺酸钠溶液（4.16）稀释标准储备液
（4.19），配成适当浓度的标准工作溶液，现用现配.
5仪器
5.1高效液相色谱仪配柱后衍生装置和荧光检测器，Pekering双通道柱后衍生装置或相当者.5.2旋涡混匀器.5.3固相萃取装置，5.4旋转蒸发器.5.5离心机. 5.6真空泵：真空度应达到80kPa.5.7pH计：测量精度士0.02.5.8具塞离心管：50ml.5. 9移液管:20 0mL. 10 0 mL、1. 0 mL 5.10滤膜过滤器：0.45μm，水相.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
将样品解冻搅拌均匀，分出0.5kg作为试样.制备好的试样置于样品瓶中，密封，并标明标记.
6.2试样保存
将试样于-18C以下保存.
7测定步额
7.1提取
称取5g试样，精确到0.01g，置于50mL离心管中.准确加入20.0mL提取液（4.14），10mL三氯甲烷（4.5），在混匀器上混合2min，混匀后于2000r/min下离心5min，上清液待净化.
7.2净化
溶液以1.5mL/min的流速通过C固相萃取柱.用10mL水淋洗C固相萃取柱，在真空泵70kPa的 将储液器装在预洗好的C固相萃取柱（4.13）上.准确移取10.0mL上清液（7.1）于储液器中，使负压下，负压抽干5min，再用4mL叔丁基甲醚-正已烷混合溶液（4.15）淋洗固相萃取柱，负压抽干5min，弃去全部淋洗液.用10mL甲醇以1.5mL/min的流速洗脱链霉素和双氢链霉素于50mL离心管中，用旋转蒸发器于45C水浴上将其减压蒸发至干.准确加人1.0mL庚烷磺酸钠溶液（4.16）溶解残渣，溶液过0.45pm的滤膜，供液相色谱测定.
7.3测定
7.3.1液相色谱条件
a）色谱柱：KromasilC5pm，250mm×4.6mm（内径），或相当者；b）流动相：0.01mol/L庚烷磺酸钠（4.16）乙（7723）；c）流速：1.0mL/min； d）柱温：45C；e）进样量：100gl；
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f）荧光检测器：激发波长263nm，发射波长447nm.
7.3.2柱后衍生化条件
a）柱后衍生剂1:0.6mmol/L 1.2-茶醒-4-磺酸钠（4.18）.流速0.3mL/min: b）柱后衍生剂2；0.2mol/L氢氧化钠（4.17），流速0 3mL/min：c）衍生温度：50C.
7.3.3色谱测定
根据样品溶液中链霉素和双氢链霉素的残留量，选择峰面积相近的标准工作溶液.标准工作溶液和样品溶液中链霉素和双氢链霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内.对标准工作溶液和样品溶 液等体积参插进样进行测定，在上述色谱条件下，链霉素的保留时间约为34.2min，双氢链霉素的保留时间约为 35.6 min.
链霉素和双氢链霉素标准物质的色谱图见图A.1.
7.4空白试验
除不加人试样外，均按上述步骤进行.
8结果计算
结果用色谱数据处理机或按式（1)计算，计算结果需扣除空白值：
.(1)
式中：
X-试样中链霉素（双氢链霉素）的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A样液中链霉素（双氢链霉素）的峰面积； -标准工作溶液中链霉素（双氢链霉素）浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；V样液定容体积，单位为毫升（mL）；A标准溶液中链霉素（双氢链霉素）的峰面积；--最终样液代表的试样质量，单位为克（g）.
9检测低限、回收率
9.1检测低限
蜂王浆中链霉素的检测低限为0.020mg/kg，双氢链霉素的检测低限为0.080mg/kg.
9.2回收率
蜂王浆中链霉素在添加水平0.020mg/kg~0.100mg/kg，其回收率范围为87.4%~93.0%：双氢链霉素在添加水平0.080mg/kg~0.400mg/kg.其回收率范围为80.4%~90.9%.
