中华人民共和国国家标准
GB/T21167-2007
蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of nitrofuran metabolites residues in royal jellyLC-MS/MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.本标准主要起草人：丁涛、徐锦忠、沈崇钰、吴斌、陈惠兰、赵增运、张扬、朱春、蒋原、陶宏锦.
蜂王浆中硝基呋喃类代谢物残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了蜂王浆中映响它酮的代谢物5-甲基吗咻-3-氨基-2-曙唑烷基酮（简称AMOZ）、呋晴西林的代谢物氨基脲（简称SEM）、映喘妥因的代谢物1-氨基-2-内酰脲（简称AHD）和映喘唑酮的代谢物3-氨基-2-晒唑烷基酮（简称AOZ）残留量的液相色谱-串联质谱的测定.
本标准适用于蜂王浆中硝基呋响类代谢物残留量的测定.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-1992neqISO3696：1987）
3方法提要
白组织结合，十分稳定.利用三氯乙酸溶液沉淀王浆中蛋白质后，邻硝基苯甲醛作为衍生化试剂避光衍 硝基呋确类药物在动物体内迅速分解，其原位稳定性只有数小时，而其代谢物在动物体内容易和蛋生化16h.乙酸乙酯提取浓缩后，用液相色谱-串联质谱仪测定，内标法定量.
4试剂和材料
4.1水：应符合GB/T6682规定的一级水， 4.2甲醇：HPLC级.4.3乙酸乙酯：HPLC级.4.4乙酸铵：HPLC级.4.5三氯乙酸：分析纯.4.6无水磷酸氢二钾：分析纯. 4.7二甲基亚：分析纯.4.8邻硝基苯甲醛：分析纯.4.9同位素内标：AHDC3.AMOZ-DS，AOZ-D.SEMHC1-（”C N2），100pg/mL，纯度≥98%.4.11AOZ、SEM、AMOZ和AHD 标准储备溶液：1mg/mL.准确称取适量的 AOZ、SEMHCI、 4.10AOZSEMHCIAMOZ和AHDHC1标准品：纯度≥98%.AMOZ和AHDHCI标准品（4.10）.用甲醇（4.2）配成1.Omg/mL的标准储备液.储备液贮存在4C冰箱中，1年有效.4.12AOZ、SEM、AMOZ和AHD标准工作溶液：用流动相分别配成浓度为10Ong/mL、10ng/mL标准工作溶液，标准工作溶液在4C保存，3个月有效. 4.13内标溶液：用流动相配制浓度为50ng/mL四种内标混合溶液，内标混合溶液在4C保存，1年有效.
4.14衍生化溶液：50mmol/L邻硝基苯甲醛.称取0.0378g的邻硝基苯甲醛（4.8）到50mL烧杯中，加人5mL二甲基亚祺（4.7）溶解，现配.4.16三氯乙酸溶液[25%（质量浓度）]：称取25g三氯乙酸溶解于100mL水中. 4.15磷酸氢二钾缓冲液（1mol/L)：称取87.1g无水磷酸氢二钾（4.6）.加入500mL水溶解.
5仪器
5.1液相色谱-中联质谱仪（中联四极杆）：配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.01g和0.1mg各一台. 5.3旋转蒸发仪或相当者.5.4水浴振荡器.5.5旋涡混匀器.5.6真空泵：真空度应达到80kPa5.7离心机. 5.8移液器：5mL.200L5.9离心管：50mL，具塞.
6试样的制备与保存
6.1试样制备
将实验室样品搅拌均匀，分出0.5kg作为试样.制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记.
6.2试样保存
将试样于冷冻状态下保存（一18C）.
7测定步额
7.1提取
准确称取2.00g试样，置于50mL具塞离心管中，准确加入0.100mL四种标准内标混合溶液2500r/min离心5min，转移上层清液于干净50mL玻璃离心管中，加人150uL邻硝基苯甲醛溶液， （4.13）、2mL25%三氧乙酸溶液、3mL水，于液体混匀器上快速混合1min，室温下振荡60min.37C水浴振荡过夜（16h）.取出样品，冷却到室温后，加入4mL磷酸氢二钾缓冲溶液（4.15）.调节样品溶液pH 7~7.5.加入10mL乙酸乙酯，混合30 s，2500r/min离心5min，取上层乙酸乙酯溶液到50mL玻璃试管中，再加入8mL乙酸乙酯，重复上述提取步骤，合并提取液，40C水浴旋转蒸发干.用甲醇水溶液（46）1.0mL定容，过0.45um的滤膜到进样瓶中，供液相色谱-中联质谱仪测定.
7.2标准溶液的衍生化
分别准确移取100 ng/mL 和 10 ng/mL四种标准混合溶液（4. 12)0.20 mL、0.10 mL和0 050 mL到干净的50mL玻璃离心管中，准确加入0.100mL四种标准内标混合溶液（4.13）、0.5mL1mol/LHCl、150pL邻硝基苯甲醛溶液（4.14）.于旋误混勾器上快速混合30s 37C水浴振荡过夜（16h）.按照样品提取步骤处理（7.1）后，供液相色谱-串联质谱仪测定.
7.3测定
7.3.1液相色谱条件
a）色谱柱：C，5pm，150mm×2.1mm（内径），或相当者；b）流动相：甲醇（A）0.5mmol/1乙酸铵水溶液（B）； c）流速：0.25ml/min;d）梯度洗脱程序：0 min~6. 0 min 20%~60% A，6 min~8 min 60% A.8 min~ 9 min 60% ~80 % A 9 min ~9. 1 min 80 % ~20 % A 9 1 min ~ 10. 5 min 20 % A;
e）柱温：室温；
f）进样量：25gl.
7.3.2串联质谱条件
离子源：电喷雾离子化电离源（ESI），正离子监测：扫描方式：选择离子检测（SRM）：雾化气、鞘气为高纯氮气，碰撞气为高纯氮气： 喷雾电压、碰撞电压等电压值均优化至最佳灵敏度：d) e）选择离子对见表1.
表1选择离子对
测定物质 母离子 子离子（m/x） (m/z)AOZ 236 0 134 0* 104 0AOZ- D 240.0 134 0*166 0aS 209 0 192 0SEM-(C "N2） 212.0 168.0°AHD 249 0 134*178AHDC3 252 0 134AMOZ 335 0 291262定量离子. AMOZ - DS 340.0 296. 0*
7.3.3液相色谱-串联质谱测定
衍生化后的标准工作溶液（7.2）在液相色谱-串联质谱设定条件下分别进样，以标准与内标物峰面积比值为纵坐标，工作溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中标准的响应值均应在仪器测定的线性范围内.在上述色谱条件下，其相应的标准物 质、内标色谱图和串联质谱图参见图A.1和图A.2.
7.4空白试验
除不加人试样外，按上述步骤进行.
8结果计算
结果用色谱数据处理机或按式（1）计算样品中硝基映响代谢物的浓度，结果需扣除空白值：
式中：
样品中硝基呋响代谢物的浓度，单位为微克每千克（ug/kg）：A.一标准品中硝基呋响代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值； 硝基映响代谢物标准的质量，单位为纳克（ng）；m样品质量，单位为克（g）.
A一样品中硝基呋响代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值：
