中华人民共和国国家标准
GB/T21314-2007
动物源性食品中头孢匹林、头孢噻呋 残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法
Determination of cephapirin and ceftiofur residuesin foodstuffs of animal origin-LC-MS/MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准附录A、附录B、附录C为资料性附录.本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院. 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.本标准主要起草人：李一尘、林维宣、唐英章、田苗、彭涛、于灵、隋凯、杨春光、王宏伟.本标准为首次发布.
动物源性食品中头孢匹林、头孢噻味 残留量检测方法 液相色谱-质谱/质谱法
1范围
本标准规定了动物源性食品中头孢匹林、头孢噻呋残留量液相色谱-质谱/质谱测定和确证方法.本标准适用于动物肌肉、肝脏、肾脏、鸡蛋和牛奶中头孢匹林（cephapirin）、头孢噻呋（ceftiofur）残留量的检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682-1992分析实验室用水规格和试验方法（neqISO3696：1987)
3原理
样品中头孢匹林、头孢噻呋残留物用乙-水溶液提取，提取液经浓缩后，用缓冲溶液溶解，固相萃取小柱净化，洗脱液经氮气吹干后，用液相色谱-质谱/质谱测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682一1992规定的一级水.
4.2甲醇：高效液相色谱级. 4.1乙睛：高效液相色谱级.4.3甲酸：高效液相色谱级.4.4氯化钠4.5氢氧化钠.4.6磷酸二氢钾. 4.7磷酸氢二钾4.80.1mol/L氢氧化钠：称取4g氢氧化钠，并用水稀释至1000mL.4.9乙晴水（152，体积比）.4.10乙睛水（3070，体积比）.4.110.05mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=8.5）:称取8.7g磷酸氢二钾.超纯水溶解，稀释至 1000mL.用磷酸二氢钾调节pH值至8.5土0.1.4.120.025mol/L磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）：称取3.4g磷酸二氢钾，超纯水溶解，稀释至1000mL.用氢氧化钠调节pH值至7.0士0.1.4.130.01mol/L乙酸铵溶液（pH=4.5）：称取0.77g乙酸铵，超纯水溶解，稀释至1000mL，用甲酸4.14头孢匹林、头孢噻呋标准品：纯度均大于等于95%. 调节pH值至4.5±0.1.4.15头孢匹林、头孢噻呋标准储备溶液：分别称取适量标准品（4.14）.分别用乙晴水溶液（4.10）溶解
GB/T 21314-2007
定容至100mL，溶液浓度为100μg/mL，置于-18C冰箱避光保存，保存期5d.4.16头孢匹林、头孢噻映混合标准中间液：分别吸取适量标准储备液（4.15）于100mL容量瓶中，用磷酸盐缓冲溶液（4.12）定容至刻度，配成混合标准中间液.混合标准中间液中头孢匹林、头孢噻呋的浓 度分别为100ng/mL、5000ng/mL.置于一4C冰箱避光保存，保存期5d.4.17混合标准工作液：精密量取混合标准中间溶液（4.16）适量，用空白样品基质配制成不同浓度系列的混合标准工作溶液（用时现配）.4.18固相萃取C柱：500mg，6mL.使用前用甲醇和水预处理，即先用2mL甲醇淋洗小柱，然后用1 mL水淋洗小柱.
5仪器
5.1液相色谱-质谱/质谱仪：配有电喷雾离子源.5.2旋转蒸发器.5.3固相萃取装置. 5.4离心机.5.5均质器.5.6旋涡混合器.5.7pH计. 5.8氮吹仪.
6试样制备与保存
取代表性样品，用组织捣碎机充分鹅碎，装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一18C以下冷冻存放.
7检测步骤
7.1提取
7.1.1肝脏、肾脏、肌肉组织、鸡蛋样品
称取约5g试样（精确到0.01g）于50mL离心管中，加人15mL乙晴水溶液（4.9），均质30s，4000r/min离心5min，上清液转移至50mL离心管中；另取一离心管，加人10mL乙晴水溶液（4.9），洗涤均质器刀头，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，加入上述洗涤均质器刀头溶液，在旋涡混合器上振荡1 min，4.000r/min离心5min，上清液合并至50mL离心管中，重复用10mL乙水溶液（4.9）洗涤刀100 mL鸡心瓶. 头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙晴水溶液（4.9）定容至40mL.准确移取20mL人
7.1.2牛奶样品
称取10g样品（精确到0.01g）于50mL离心管中.加入20mL乙晴（4.9），均质提取30s，100mL鸡心瓶.
4 000r/min离心5min.上清液转移至50mL离心管中；另取一离心管，加人10mL乙晴水溶液（4.9），1 min，4000r/min离心5min，上清液合并至50mL离心管中，重复用10mL乙水溶液（4.9）洗涤刀 洗涤均质器刀头，用玻棒捣碎离心管中的沉淀，加入上述洗涤均质器刀头溶液，在旋涡混合器上振荡头并提取一次，上清液合并至50mL离心管中，用乙晴水溶液（4.9）定容至50mL.准确移取25mL人
将鸡心瓶于旋转蒸发器上（37C水浴）蒸发除去乙晴（易起沫样品可加人4mL饱和氯化钠溶液）.
7.2净化
立即向已除去乙晴的鸡心瓶中加入25mL磷酸盐缓冲溶液（4.11），涡旋混匀1min.用0.1mol/L氢氧化钠调节pH值为8.5，以1mL/min的速度通过经过预处理的固相萃取柱，先用2mL磷酸盐缓冲2
溶液（4.11）淋洗2次，再用1mL超纯水淋洗.用3mL乙晴洗脱（速度控制在1mL/min）.将洗脱液于45C下氮气吹干，用0.025mol/L磷酸盐缓冲溶液（4.12）定容至1mL，过0.45μm滤膜后，立即用液相色谱-质谱/质谱仪测定.
7.3测定
7.3.1液相色谱条件
7.3.1.2流动相：A组分是0.01mol/L乙酸铵溶液（甲酸调pH至4.5）：B组分是乙睛.梯度洗脱程序见表1.
7.3.1.1色谱柱：COSMOSILC柱，250mm×4.6mm（内径），粒度5pm.
表1梯度洗脱程序
步 时间/min 流速/（ml/min） 组分A/% 组分B/%1 0 00 1.0 98 0 2 02 3 00 1.0 98 0 2 03 5 00 1 0 90 0 10 04 15 00 1 0 70 0 30 05 20 00 1 0 98 0 2. 0
7.3.1.3流速： 1.0 mL/min.7.3.1.4进样量：100pL.
7.3.2质谱条件
7.3.2.1离子源：电喷雾离子源.7.3.2.2扫描方式：正离子扫描.7.3.2.3检测方式：多反应监测.
7.3.2.4雾化气、气帘气、辅助气、碰撞气均为高纯氮气：使用前应调节各参数使质谱灵敏度达到检测 要求，参考条件见附录A.
7.3.3液相色谱-质谱/质谱测定
根据试样中被测物的含量情况，选取响应值相近的标准工作液一起进行色谱分析.标准工作液和待测液中头孢匹林、头孢曝映的响应值均应在仪器线性响应范围内.对标准工作液和样液等体积进行测定.在上述色谱条件下头孢匹林和头孢噻呋的参考保留时间分别约为12.2min、13.0min.标准溶 液的选择性离子流图见图B.1.
7.3.4定性测定
按照上述条件测定样品和建立标准工作曲线，如果样品中化合物质量色谱峰的保留时间与标准溶液相比在土2.5%的允许偏差之内：待测化合物的定性离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于3 （S/N≥3），定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于10（S/N≥10）：定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准溶液相比，相对丰度偏差不超过表2的规定，则可判断样品中存在相应的目标化合物，
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 >50% >20%~50% >10% ~20% ≤10%允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% %0干
7.3.5定量测定
按外标法使用标准工作曲线进行定量测定.
7.3.6空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行.
