中华人民共和国国家标准
GB/T22957-2008
河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of nine glucocorticoids residues in fugu.eel and baked eelLC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局.本标准主要起草人：刘永明、李金、吴艳萍、冯冠、曹彦忠、庞国芳.
河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了河豚鱼、鳗鱼及烤鳗中凌尼松龙、泼尼松、氢化可的松、可的松、甲基凌尼松龙、倍他米松、地塞米松、倍氯米松、醋酸氟氢可的松九种糖皮质激素残留量的液相色谱-串联质谱测定方法.
本标准适用于河原鱼，鳗鱼及烤鳗中九种糖皮质激素残留量的测定.
本标准的方法检出限：泼尼松龙、凌尼松、氢化可的松、可的松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松为0.2μg/kg：倍氯米松、醋酸氟氢可的松为1.0pg/kg.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
(GB/T 6379. 12004 IS 5725-1:1994 IDT)
性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987，MOD）
3原理
河豚鱼、鳗鱼、烤鳗样品中加入无水硫酸钠，用乙酸乙酯提取，提取液浓缩后，经过硅胶固相萃取柱净化液相色谱-中联质谱仪测定，外标法定量.
4试剂和材料
4.1水：GB/T6682，-级. 4.2甲醇：色谱纯.4.3乙睛：色谱纯.4.4乙酸乙酯：色谱纯.4.5甲酸：优级纯.4.6正已烷：色谱纯. 4.7丙酮：色谱纯.4.8丙酮-正已烷溶液：丙酮正已烷（23）.量取200mL丙酮与300mL正已烷混勾.4.9无水硫酸钠：分析纯.在650C马弗炉中灼烧6h，储存于干燥器中.4.10尼松龙（CAS：50-24-8）、泼尼松（CAS：53-03-2）、氢化可的松（CAS：50-23-7）、可的松（CAS：53-06-5）、甲基泼尼松龙（CAS：83-43-2）、倍他米松（CAS：378-44-9）、地塞米松（CAS：50-02-2）、倍氯米松 （CAS：4419-39-0）、醋酸氟氢可的松（CAS：514-36-3）标准物质：纯度98%.4.111.0mg/mL标准储备溶液：分别准确称取适量的糖皮质激素标准物质，用甲醇溶解，分别配制成
1.0mg/mL储备溶液.配成的标准储备液应在温度低于一20C冰箱中保存.4.125.0μg/mL标准工作溶液：分别准确吸取适量的糖皮质激素标准储备溶液，用甲醇分别配制成5.0μg/mL标准工作溶液.配成的标准工作溶液应在温度低于4C冰箱中保存. 4.13混合标准工作溶液1：分别吸取适量的氢化可的松和可的松标准工作溶液，用甲醇配成浓度为0.05pg/mL的混合标准工作溶液.此溶液应在温度低于4C冰箱中保存.测定样品使用时，用20%乙溶液将混合标准工作溶液I配成不同浓度的的混合标准工作溶液.4.14混合标准工作溶液Ⅱ：分别吸取适量的浚尼松龙、涉尼松、甲基泼尼松龙、倍他米松、地塞米松、倍松为0.05pg/mL，倍氯米松、醋酸氟氢可的松为0.25pg/mL的混合标准工作溶液.此溶液应在温度 氯米松、醋酸氟氢可的松标准工作溶液，用甲醇配成泼尼松龙、泼尼松、甲基浚尼松龙、倍他米松、地塞米低于4C冰箱中保存.4.15基质混合标准工作溶液：用空白样品提取液将混合标准工作溶液Ⅱ配成不同浓度的基质混合标准工作溶液.此溶液应现用现配.4.16Cleanert Silica固相萃取柱或相当者；500mg，6mL.使用前用6mL正已烷预处理，保持柱体 湿润.4.17滤膜：0.2 um.
5仪器
5.1液相色谱-中联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）.5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g.5.3固相萃取真空装置.5.4真空泵：真空度应达到80kPa5.5均质器. 5.6振荡器.5.7高速冷冻离心机：转速13000r/min.5.8旋转蒸发器.5.9氮气浓缩仪.5.10具塞塑料离心管：50mL. 5.11样品管：10 mL.5.12梨形瓶：150mL.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
从全部样品中取出有代表性样品约1kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内.密封作为试样，注明标记.在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化.
6.2试样保存
将试样于-18C冷冻保存.
7测定步骤
7.1提取
称取5g试样（精确到0.01g），置于50mL具塞塑料离心管中，加人10g无水硫酸钠，加25mL乙
1）Cleanert Sicn固相萃取柱是Agela公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该产品的认可.如果其他等效产品具有相同的效果.则可使用这些等效产品.
中.再用25mL乙酸乙酯提取一次，合并上清液，用旋转蒸发器于45C水浴上减压蒸发至近干，用1 mL乙酸乙酯和5mL正已烷溶解.
7.2净化
将提取液移至经预处理的CleanertSilica固相萃取柱中，用6mL正已烷洗涤梨形瓶和萃取柱，弃去全部流出液.减压抽干1min，用6mL丙酮正已烷（23）洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中，用氮气浓缩仪吹干，用1mL20%乙溶液溶解残渣，以4000r/min离心5min，上清液过0.2μm滤膜，供液相色谱-申联质谱仪测定.
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Atlantis C3μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者；b）柱温：30C； 进样量：20μ;c) d) 流动相、流速和梯度洗脱条件见表1.
表1流动相、流速和梯度洗脱条件
时间/min 流速/（pl/min） 乙晴/% 0.1%甲酸溶液/%0 00 200 20 8010 00 200 70 3013 00 200 90 10101 200 20 8020 00 200 20 80
7.3.2质谱参考条件
a) 离子源：电喷雾离子源（ESI）；b) 扫描方式：负离子扫描；c) 检测方式：多反应监测：d) 雾化气压力；0.276MPa； 气帘气压力：0.138MPa；e) f) 输助加热气压力：0.138MPa；g) 离子源温度：500C；h) 定性离子对、定量离子对、去簇电压和碰撞能量见表2.
表2 糖皮质激素的定性离子对、定量离子对、去电压和碰撞能量
化合物中文名称 化合物英文名称 定性离子对（/=） 定量离子对（m/2） 去额电压/V 磁撞能量/V菠尼松龙 prednisolone 405/329 696/s0p 405/329 30 30 25 15403/327 19 21泼尼松 prednisone 403/357 403/327 19 15407/331 28 25氢化可的松 bydrocortisone 407/361 407/331 28 15可的松 cortisone 628/50 625/90 22 24405/359 22 15
