中华人民共和国国家标准
GB/T22981-2008
Determination of bacitracin residues in milk and milk powder-LC-MS-MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B为资料性附录.本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口.疫局.本标准主要起草人：段文仲、马育松、郭春海、王风池、葛娜、艾连峰、窦彩云、吕红英、庞国芳.
牛奶和奶粉中杆菌肽残留量的测定 液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了牛奶和奶粉中杆菌肽残留量的液相色谱-中联质谱测定方法.本标准适用于牛奶和奶粉中杆菌肽残留量的测定和确证.本标准的方法检出限：牛奶50.0μg/kg；奶粉250μg/kg.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义(GB/T 6379. 1-2004 ISO 5725-1;1994 IDT)
GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复性与再现性的基本方法（GB/T6379.2-2004，ISO5725-2：1994，IDT)
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，ISO3696：1987.MOD)
3原理
试样中的杆菌肽残留用乙睛-甲醇提取试样中的杆菌肽残留，液相色谱-中联质谱仪测定，外标法定量.
4试剂和材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水，
4.1甲醇：色谱纯.4.2乙腊晴：色谱纯.4.4乙晴-甲醇（21）：量取200mL乙晴（4.2）与100mL甲醇（4.1）混合. 4.3甲酸：色谱纯.4.50.1%甲酸溶液：移取1mL甲酸（4.3）于装有约800mL水的1L容量瓶中，用水定容至刻度并混匀.4.60.1%甲酸甲醇溶液：移取1mL甲酸于装有约800mL甲醇的1L容量瓶中，用甲醇定容至刻度4.7杆菌肽标准物质：杆菌肽A（CAS：1505-87-4）纯度大于等于92.0%，以下杆菌肽标准均以杆菌肽 并混匀.A计.4.8杆菌肽标准储备溶液：准确称取适量的杆菌肽A（4.7）于50mL容量瓶中.用0.1%甲酸甲醇溶液配制成浓度为0.1mg/mL的标准储备溶液.该溶液在4C保存.4.9杆菌肽标准工作溶液：移取杆菌肽标准储备溶液（4.8)1.0mL于10mL容量瓶中，用0.1%甲酸 甲醇溶液定容，配制成浓度为10.0pg/mL.的标准工作溶液.该溶液在4C保存.4.10杆菌肽基质标准工作溶液：根据需要吸取适量的杆菌肽标准工作溶液（4.9），用空白样品提取液
稀释成适当浓度的基质标准工作溶液，临用前配制.
GB/T 22981-2008
5仪器和设备
5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g 5.1液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子源.5.3涡旋振荡器5.4离心机：转速不低于5000r/min.5.5具塞离心管：50mL，带刻度.
6试样的制备与保存
6.1牛奶
取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封置4C下保存，并标明标记.
6.2奶粉
取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封，并标明标记.
7测定步骤
7.1牛奶样品
称取5g试样（精确到0.01g）置于50mL离心管中，加人10mL乙晴-甲醇（21）（4.4），涡旋提取1 min，以5000r/min离心10min，移取上清液于50mL刻度离心管中，以0.1%甲酸溶液（4.5）定容至 15mL，摇匀，用0.22pm滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱仪测定.
7.2奶粉样品
称取1g试样（精确到0.01g）置于50mL离心管中，加人5mL水，误旋混匀后，加人10mL乙晴-甲醇（21）（4.4），以下操作同牛奶样品.
7.3测定条件
7.3.1液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：a）色谱柱：苯基柱，5.0μm.150mm×2.1mm（内径）或相当者：b）液相色谱梯度洗脱条件见表1：d）进样量：20gL c）柱温：40C：
表1液相色谱梯度洗脱条件
时间/min 流速/(μL/min) 水（含0.1%甲酸1/% 乙精/%0.00 200 85 0 15. 05 00 200 60 0 40 06 00 200 60 0 40.08 00 200 20 0 80 08 01 200 85.0 15.010 00 200 85 0 15 0
7.3.2质谱参考条件
质谱参考条件如下：a）离子源：电喷雾离子源：b）扫描方式：正离子扫描；
c）检测方式：多反应监测：d）辅气压力：2.07×10²Pa：f）正离子模式电喷雾电压（IS)：4000V； e）输助气压力：5.52×10Pa；g）毛细管温度：320C；h）源内诱导解离电压：10V；i）Q1.Q3分辨率：Q1为0.4.Q3为0.7；j）碰撞气：高纯氯气； k）碰撞气压力：0.2Pa；1）其他质谱参数见表2.
表2杆菌肽的参考保留时间、定性离子对、定量离子对和裂解能量
化合物名称 保留时间/min 定性离子对（/=) 定量高子对（m/=） 裂解能量/eV杆菌肽 6 42 475 3/669 3 475 3/669 3 15475 3/869 4 15
7.3.3液相色谱-串联质谱测定
7.3.3.1定性测定
样品谱图中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较，偏差不超过表3规定的范围，则可判定为样品中存在对应的待测物.
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差
%
相对离子丰度k >50 20<<50 10<<.20 k≤10允许的相对误差 ±20 ±25 ±30 ±50 7.3.3.2定量测定 在上述色谱条件下，用6个不同浓度的杆菌肽基质标准工作溶液分别进样，以标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线.用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中杆菌肽的响应值应在仪器测定的线性范围内.在上述色谱条件和质谱条件下，杆菌肽标准物质的多反应监测（MRM）色谱图参见附录A中的图A.1.杆菌肽的参考保留时间为6.42min. 本方法的添加回收率数据参见附录B中的表B.1. 7.4平行试验 按上述步骤，对同一试样进行平行试验测定. 7.5空白试验 除不称取试样外，均按上述分析步骤进行. 8结果计算 杆菌肽残留量利用数据处理系统计算或按式（1）计算： 式中： X--试样中杆菌肽残留量，单位为微克每千克（gg/kg）；V试样溶液定容体积.单位为毫升（mL）； 从标准工作曲线得到的试样溶液中被测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）：最终试样溶液所代表的试样质量，单位为克（g）.计算结果应扣除空白值.
