中华人民共和国国家标准
GB/T 23407-2009
蜂王浆中硝基咪唑类药物及其 代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法
Determination of residues of nitroimidazoles andtheir metabolites in royal jelly-LC-MS/MSmethod
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A、附录B、附录C和附录D为资料性附录，本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.本标准主要起草人：丁涛、吴斌、徐锦忠、张晓燕、张婧、杨安南、郭玲、蒋原、陶宏锦.
蜂王浆中硝基咪唑类药物及其 代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法
1范围
本标准规定了蜂王浆中甲硝唑（简称MNZ，下同），二甲硝味唑（简称DMZ，下同）及其代谢物2-羟甲基-1-甲基-5-硝基咪唑（简称HMMNI，下同），异丙硝唑（简称IPZ，下同）及其代谢物2-（2-羟异丙基）1-甲基-5-硝基味唑（简称IPZOH），洛硝哒唑（简称RNZ，下同）残留量的液相色谱-串联质谱的测定方 法.上述硝基咪唑类药物中英文名称、结构式、CAS号和相对分子质量参见附录A.
本标准适用于蜂王浆中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定.
2规范性引用文件
的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696：1987.MOD）
3方法提要
试样加人相应内标，用氢氧化钠溶液溶解，乙酸乙酯提取硝基咪唑类药物及其代谢物，阳离子柱富集净化，利用液相色谱-串联质谱仪测定，梯度洗脱，内标法定量.
4试剂和材料
除非另有说明，试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：HPLC级.4.2乙睛.4.3乙酸乙酯.4.5氢氧化钠溶液：0.25mol/L. 4.4乙酸铵：HPLC级.4.6甲酸（85%）.4.7氨水（28%）4.8阳离子交换柱（PCX）：60mg3mL.4.9甲酸乙晴溶液：量取适量甲酸（4.6）于适量乙晴（4.2）中，浓度为10%（体积分数）. 4.10氨水甲醇溶液：量取适量氨水（4.7）于适量甲醇（4.1）中，浓度为5%（体积分数）.4.11同位素内标：DMZ-DIPZOH-D、HMMN1-D，纯度≥98%.4.12MNZ、DMZ、HMMN1、IPZ、IPZOH和RNZ标准品：纯度>98%.4.13MNZ、DMZ、HMMN1、IPZ、IPZOH和RNZ标准储备溶液：1mg/mL.准确称取适量的MNZ、 DMZ、HMMNI IPZ、IPZOH和RNZ标准品（4.12) 用甲醇（4.1)配成1.0mg/mL的标准储备液，储备液贮存在4C冰箱中，可保存6个月.4.14DMZ-DIPZOH-D 和 HMMNI-D内标储备溶液：100pg/mL.称取适量的 DMZ-DIPZOH-D 和
HMMNI-D.内标物（4.11），用甲醇（4.1）配成100μg/mL储备液，储备液贮存在4C冰箱中，可保存6个月.4.15DMZ-D 、IPZOH-D 和HMMNI-D 内标工作溶液：1μg/mL.取适量内标储备液（4.14）用甲醇 （4.1）稀释成1μg/mL工作溶液，内标工作溶液在4C保存.4.16MNZ、IPZ、IPZOH、DMZ、HMMNI和RNZ标准工作溶液：用甲醇-水（28，体积比）分别配成浓度范围为1ng/mL~100ng/mL标准工作溶液，其中内标溶液浓度为50ng/mL，现配.
4.17甲醇-水（28，体积比）：量取20mL甲醇于80mL水中，混合均匀.
5仪器
5.1液相色谱-质谱/质谱仪（中联四极杆）：配有电喷雾离子源.5.2分析天平：感量0.01g和0.1mg各一台.5.3旋转蒸发仪或相当者.5.5真空系：真空度不低于80kPa 5.4涡旋混匀器.5.6离心机：转速不低于2500r/min.5.7移液器：5mL.200gL.5.8离心管：50mL.具塞.5.9滤膜：有机相，0.45μm.
6试样的制备与保存
6.1试样的制备
将王浆样品搅拌均匀，分出0.5kg作为试样.制备好的试样置于样品瓶中，密封，并做上标记，在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留含量变化.
6.2试样的保存
将试样于冷冻下保存.
7测定步骤
7.1提取
50pL，加人氢氧化钠溶液（4.5）10mL混合15s，溶解样品.加人10mL乙酸乙酯（4.3），混合30s， 准确称取5g（精确到0.01g）试样，置于50mL具塞离心管中，准确加人3种内标混合溶液（4.14）2 500r/min离心3min，取上层乙酸乙酯到50mL玻璃试管中，再加入10mL乙酸乙酯（4.3），重复上述提取步骤，合并提取液，40C水浴旋转蒸发干，5mL甲酸乙晴溶液（4.9）溶解.3mL甲醇、3mL水活化固相萃取柱，上样，3mL水洗，抽至近干，3mL氨水甲醇溶液（4.10）洗脱，45C水浴旋转蒸发干，用甲醇-水（4.17)1.0mL定容，过滤到进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定.
7.2测定
7.2.1液相色谱条件
a）色谱柱：Ci（封端），3pm，150mm×2.0mm（内径）或相当者：b）流动相：甲醇5mmol/L乙酸铵溶液；c）流速：0.20mL/min; d）梯度洗脱程序：参见附录B；e）柱温：室温；f）进样量：25.
7.2.2串联质谱条件
参见附录C.
7.3液相色谱-质谱测定
7.3.1定性测定
进行样品测定时，如果检出的质量色谱峰保留时间与标准样品一致，并且在扣除背景后的样品谱图中，各定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差不超过表1中规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物.
表1定性确证时相对离子丰度的最大允许相对偏差
允许的相对偏差 相对离子丰度 >50% ±20% >20%~50% ±25% >10%~20% ±30% ≤10% ±50%
7.3.2定量测定
标准工作溶液（4.16）在液相色谱-申联质谱设定条件下分别进样，以标准与内标物峰面积比值为纵坐标，工作溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制6点标准工作曲线（1ng/mL~100ng/mL）.用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中标准的响应值均在仪器测定的线性范围内.其中DMZ-D，作为MNZ使用.在上述色谱条件下，其相应的标准物质和内标离子流色谱图参见附录D. 和DMZ内标使用：HMMNI-D作为HMMNI和RNZ内标使用：IPZOH-D作为IPZ和IPZOH内标
7.4平行试验
按以上（7.1~7.3）步骤，对同一试样进行平行试验测定.
7.5空自试验
除不称取试样外，均按上述（7.1~7.3）步骤进行.
8结果计算
结果用色谱数据处理机或按式（1)计算：
( 1)
式中：
A-样品中硝基味唑及其代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值； -样品中硝基咪唑及其代谢物的浓度，单位为微克每千克（μg/kg）；c硝基咪唑及其代谢物标准的质量，单位为纳克（ng）：A.-标准品中硝基味唑及其代谢物的峰面积与相应内标峰面积比值；-样品质量，单位为克（g）.
注：计算结果需扣除空白值.
9检测低限、回收率范围和精密度
本标准中MNZ、DMZ、RNZ和IPZ测定低限为2.0μg/kg，HMMNI和IPZUH 测定低限为5.0 yg/kg-
蜂王浆中硝基咪唑及其代谢物添加浓度及回收率范围（内标校正）的试验数据（a=10）：
添加水平为2.0μg/kg，MNZ、DMZ RNZ和IPZ平均回收率范围为98%~100%；
添加水平为20μg/kg，HMMN1和IPZOH平均回收率范围为96%~97%.
在 2.0μg/kg、5.0μg/kg、10μg/kg和 20μg/kg 添加水平上，相对标准偏差（RSD）为 3.2%~7.2%.
