中华人民共和国国家标准
GB/T 23815-2009
Protocol of the polymerase chain reaction for detecting plant ponents in meat
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.本标准负责起草单位：国家加工食品质量监督检验中心（广州）、广州市质量监督检测研究院、中华 本标准由中国标准化研究院提出并归口.人民共和国深圳出入境检验检疫局.
本标准主要起草人：郭新东、邓鸿铃、覃芳芳、罗海英、袁洁、吴玉銮、谢文斌.
猪肉制品中植物成分定性PCR检测方法
1范围
本标准规定了猪肉制品中植物成分的定性PCR检测方法.本标准的检出限为0.5ng植物DNA. 本标准适用于由猪肉制成的半成品和成品中植物成分的定性检测.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682-2008，1SO3696:1987，MOD）
3术语和定义
GB/T19495.1确立的术语和定义适用于本标准.
4防污染措施
检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行.
5抽样和制样
按照GB/T19495.7规定的方法执行.
6测定方法
6.1原理
样品经过提取DNA后，针对植物特异基因的序列设计引物，通过PCR技术，特异性扩增植物基因的DNA片段，根据PCR扩增结果，判断该样品中是否含有植物成分.
6.2试剂和材料
除另有规定外，所用试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水.
6.2.1引物：检测猪肉制品内源和外源基因的引物及其信息见表1.
表1猪肉制品内、外源基因所需的引物信息
检测基因 引物序列 PCR产物大小/ bp 基因性质 适用范围tRNALeu 反 :5′-TTCCATTGAGTCTCTGCACCT-3* E ;5′-CGAAATCGGTAGACGCTACG-3* 193 植物叶绿体 猪肉制品5′-AAGTTAGAGATCGGGAGCCTAA-3*mitochondrion 5′-AAGGTGACAATAGGTAGTCC-3′ 264 猪内源线粒体基因 猪肉制品
GB/T 23815-2009
6.2.2琼脂糖：电泳纯.6.2.3Tris饱和酚.6.2.4三氯甲烷. 6.2.5冰乙酸.6.2.6无水乙醇.6.2.7异戌醇，6.2.8异丙醇.6.2.10盐酸（HCI）. 6.2.9氢氧化钠（NaOH）.6.2.12乙二胺四乙酸钠盐（NaEDTA）.6.2.13蔗糖.6.2.14溴酚蓝. 6.2.15乙酸钠（NaAc).6.2.16苯酚三氯甲烷异戊醇（25241，体积比）.6.2.17三氯甲烷异戊醇（241，体积比）.6.2.191×TAE电缓冲液：取50×TAE（242gTris 57.1mL冰乙酸，100ml0.5mol/L 6.2.18乙酸钠溶液：3mol/L乙酸钠溶液，乙酸调节pH为5.2.NaEDTA，用HCI或Na(OH调节pH至8.0，定容至1 L)按比例稀释.6. 2. 20TE缓冲液:Tris 0.01 mol/L NaEDTA 0.001 mol/L 用 HC1或 NaOH 调节 pH至 8. 0.6.2.21PCR试剂盒：Taq酶，dNTPs，10×Buffer，氯化镁（MgCl;）.6.2.22上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（质量浓度）蔗糖溶液. 6.2.23溴化乙锭溶液：1mg/mL，6.2.2470%乙醇.6.2.25等效DNA提取试剂盒.6.3主要仪器6.3.1PCR热循环仪.6.3.3凝胶成像系统.6.3.5涡旋振荡器.6.3.6分析天平；0.1g.6.3.8核酸蛋白分析仅或紫外分光光度计.6.4检测步骤 6.4.1模板DNA的提取6.4.1.1对照阳性对照：猪基因组DNA、植物基因组DNA；阴性对照：已知以不含该基因的样品提取的DNA； 空白对照：双蒸水（ddHO）.6.4.1.2提取步骤a）样品DNA提取时设双平行；2
6.2.11三羟甲基氨基甲烷（Tris）.6.2.26DNA分子质量标准品（50bp）.6.3.2电泳仪，6.3.4离心机：12 000 r/min6.3.7微量可调移液器：0.5μL，2pl，10pl，20 μL，100μL.200μL，1000 μl
b）将样品粉碎，取适量样品放人2.0mL离心管，加入400uLTE缓冲液（6.2.20），于65C水浴中溶解10min.上下颠倒混匀；c）加人与溶液等体积苯酚三氯甲烷异戊醇（25241)（6.2.16），摇晃混勾10min；e）加入上清液等体积三氯甲烷异戊醇（241）（6.2.17），摇晃混匀10min； d) 12000r/min室温离心10min，将上清液转移至另一干净的1.5mL离心管中；f）12000r/min室温离心10min，小心吸取上清液：h）12 000r/min室温离心 10 min，弃去上清液；i）70%乙醇（6.2.24）洗涤沉淀2次~3次，干燥DNA； j）50L0.1×TE（6.2.20）溶解沉淀，4C保存.也可以用等效DNA提取试剂盒（6.2.25）提取DNA，按试剂盒操作说明书指示进行操作.
6.4.2DNA质量的测定
样品中提取的DNA质量的测定用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计（6.3.8）进行测定.
取适量DNA溶液加TE缓冲液（6.2.20）进行稀释，用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测260 nm和 280nm 处的吸光值 A和 As.DNA 的浓度按式（1)计算：
式中：
（-DNA浓度pμg/p;
A-260nm处的吸光值；
当A/A比值在1.4以上时，可用于PCR扩增，1.7~2.0之间时，PCR扩增效果好.
6.4.3PCR扩增
6.4.3.1PCR反应体系
检测肉制品内、外源基因的PCR反应体系见表2.每个反应体系应设置两个平行反应.同时设置阳性对照、阴性对照和空白对照.
表2PCR反应体系
试剂名称 贮备液浓度 加入PCR 反应体系的体积/pl10× PCR Buffer 2 5MgCl; 25 mmol/L 2 5dNTP 2 5 mmol/1. 2 0正;0 25Primers 20 pmol/μL 反：0:25Taq 5 U/sL. 0.15Template 0 1 p /pl ~0 2 pg /pl 1ddH O 补足反应体系总体积为25
