中华人民共和国国家标准
GB/T23882-2009
Determination of L-ascorbyl-2-monophosphate in feedsHigh performance liquid chromatography
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准的附录A为资料性附录.
本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76）提出并归口.
本标准起草单位：国家饲料质量监督检验中心（武汉）、北京桑普生物化学技术有限公司、帝斯曼维生素（上海）有限公司.
饲料中L-抗坏血酸-2-磷酸酯的测定 高效液相色谱法
1范围
本标准规定了饲料中1-抗坏血酸-2-磷酸酯的高效液相色谱检测方法.
本标准适用于水产用配合饲料、浓缩饲料、添加剂预混合饲料中L-抗坏血酸-2-磷酸酯含量的测定，方法检出限为2mg/kg（以L-抗坏血酸计），定量限为10mg/kg（以 L-抗坏血酸计）.
2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用面成为本标准的条款.凡是注日期的引用文件，其随后的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然面，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本.凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1饲料采样GB/T20195动物饲料试样的制备
3原理
试样中的L-抗坏血酸-2-磷酸酯用磷酸盐缓冲溶液提取，离心，过滤，过滤液用高效液相色谱仪进行测定、外标法定量.
4试剂和溶液
除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和符合GB/T6682规定的二级水的水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2磷酸.4.3磷酸二氢钾.4.4四丁基硫酸氢铵.4.5磷酸盐缓冲溶液：54g磷酸二氢钾溶于900mL水中，用磷酸（4.2）调至pH3.0后.用水稀释 至1 000 ml.4.6流动相：称取6.8g磷酸二氢钾（4.3），0.5g四丁基硫酸氢铵（4.4），置于1000mL容量瓶中.加人约700mL水，待全部溶解后.加入75mL甲醇（4.1），用水定容至刻度，摇匀，过0.45gm滤膜，超声4.7L-抗坏血酸-2-磷酸酯标准储备液（以L-抗坏血酸计=100μg/mL）：准确称取三-环已胺-抗坏血 脱气.酸-2-磷酸酯 Ctris(cyclohexyl-ammonium) ascorbic acid-2-phosphate) (C; H N;O P 纯度 >99. 0%)标准品0.0158g（标准品以L-抗坏血酸计，换算因子为0.3184）用磷酸盐缓冲溶液（4.5）溶解并定容于50mL棕色容量瓶中.保存在4C冰箱中，有效期一个月.1.00mL，2.00mL，5.00mL，10.0mL置50mL棕色容量瓶中.用磷酸盐缓冲溶液（4.5）定容，即以L-抗坏血酸计浓度为 1. 00μg/mL，2.0μg/mL，4 00μg/mL 10. 0μg/mL，20.0μg/mL标准工作液.当日配制.
5仪器和设备
5.1高效液相色谱仪，配有紫外或二极管阵列检测器. 5.2离心机：3500r/min 5.3超声波水浴.
6采样
按照GB/T14699.1的规定执行.
7试样制备
按GB/T20195制备试样，磨碎，通过0.45mm孔筛，混匀，装人密闭容器中，避光低温保存备用.
8分析步骤
8.1提取
称取一定量的试样C含L-抗坏血酸-2-磷酸酯（以L-抗坏血酸计）约1mg]，精确至0.1mg，置于100mL容量瓶中，加入约70mL磷酸盐缓冲溶液（4.5），于超声波水浴中超声处理15min，用磷酸盐缓冲溶液（4.5）定容至刻度（V）.取适量溶液3500r/min离心5min，离心后上清液经过0.45ym滤膜过滤，滤液用于高效液相色谱分析.
8.2测定
8.2.1液相色谱参考条件
色谱柱：C柱.长250mm，内径4.6mm，粒径5um，或性能相当者.柱温：室温.流速：1.0mL/min.检测波长：250nm.进样量：20xL.
8.2.2标准曲线的绘制
向基线平稳的HPLC分析仪连续注人L-抗坏血酸-2-磷酸酯标准工作液（4.8），浓度由低到高，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程.
8.2.3定量测定
性范围则应稀释后再进样分析.依据峰面积，从标准曲线中得到待测样液中1-抗坏血酸-2-磷酸酯的浓 注人待测样液（8.1)，其中L-抗坏血酸-2-磷酸酯的峰面积响应值应在标准曲线线性范围内，超过线度（C）.有关色谱图参见附录A.
9结果计算
（mg/kg）.按式（1）计算： 试样中1-抗坏血酸-2-磷酸酯的含量（以L-抗坏血酸计）X，以质量分数表示，单位为毫克每千克
式中：
（-由标准曲线而得的试样液中L-抗坏血酸-2-磷酸酯的浓度（以1-抗坏血酸计）.单位为微克每毫升（μg/mL）;
V试样定容体积，单位为毫升（mL)；
m试样质量.单位为克（g)；》稀释倍数.测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字.
10重复性
同一实验室由同一操作人员使用同一仅器完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于15%.
