中华人民共和国国家标准
GB/T28976-2012
Detection and identification of strawberry latent ringspot virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：杨翠云、于翠、闻伟刚、郑建中、印丽萍、李彬.
草莓潜隐环斑病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了草莓潜隐环斑病毒的检疫鉴定方法.本标准适用于植物材料，包括无性繁殖材料、种子和苗本中草莓潜隐环斑病毒的检疫鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3草莓潜隐环斑病毒基本信息
学名：strawberry latent ringspot virus 中文名：草莓潜隐环斑病毒缩写：SLRSV分类地位：Secoviridae科，温州蜜柑缓缩病毒属（Saduavirus）草莓潜隐环斑病毒的其他信息参见附录A.
4方法原理
用DAS-ELISA、RT-PCR、实时荧光RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行检疫鉴定， 病毒粒子的形态特征、为害症状、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据，采
5仪器设备、设施、用具和试剂
5.1仪器设备
酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平（感量0.001g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、超低温冰箱（一80C）、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器.
5.2设施
植物隔离检疫画.
5.3用具
可调式微量移液器（2μL、10xL、100μL、200yL、1000gL）及相应的无RNase 吸头、无RNase 离心管、PCR管、研体、样品袋、标签、镊子、放大镜等.
5.4试剂
5.4.1除有特殊说明外.实验用试剂均为分析纯或生化试剂.
5.4.2SLRSV抗体、Trizol、焦碳酸二乙酯（DEPC）、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇、β-硫基乙醇、AMV反转录酶、TaqDNA聚合酶、DNA相对分子质量标记、溴化乙锭，琼脂糖、溴酚蓝等.血清学 和分子生物学检测试剂配制见附录B.
6症状观察及抽样
6.1症状观察
现场检疫主要观察进境植物材料上病毒为害的症状，SLRSV为害症状描述参见附录A.
6.2抽样
发现有病毒为害症状的植物材料直接送检；未发现症状的，则按SN/T2122中规定进行抽样，并送实验室检疫鉴定.
7检疫鉴定
7.1鉴定流程
判定样品中是否携带草莓潜隐环斑病毒，应经过两种或两种以上的检测方法相互验证.具体操作流程可参照图1.
图1SLRSV鉴定流程图
7.2双抗体酶联免疫吸附方法（DAS-ELISA）
对种苗、球茎或由种子催生长出的叶片研磨，并按质量和抽提缓冲液1：10的比例稀释，制备的汁液分别盛装于离心管中，离心后吸取上清液作为待测样品，并设阳性对照、阴性对照和空白对照.具体 操作步骤见附录C.
7.3RT-PCR方法
植株叶片、种球或种子液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA.具体操作步骤见附录D.
7.4实时荧光RT-PCR方法
植株叶片、种球或种子液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA.具体操作步骤参见附录E.
7.5鉴别寄主测定方法
在裁种于植物隔离检疫圃中的鉴别寄主植物真叶长出后用于摩擦接种，对DAS-ELISA或RT-PCR检测SLRSV呈阳性的样品加人适量接种缓冲液研磨后接种鉴别寄主.当任意一种鉴别寄主 植物出现如下描述症状时，即可判定接种成功.对接种后表现隐症的鉴别寄主植物，还需要对接种叶片结合 DAS-ELISA 或 RT-PCR 方法验证，如果结果阳性则判定样品携带 SLRSV.
a）苋色蔡（Chenopdinmamaranticolor）或昆诺藜（Chenopdiamqrinox）：接种叶7d内局部褪绿或坏死斑，以后是系统褪绿或变形，有时出现坏死或轻微的褪绿斑：b）菜豆（Phaxeolusvuigarix）：接种叶出现局部褪绿或坏死斑；c）黄瓜（Cacumis sativus）：系统感染黄瓜，引起脉间褪绿和坏死，有时无症状： d）黄花烟（Nicotiana rustica）或矮牵牛（Petuniahybrida）：属系统性侵染且无症状出现.
7.6免疫电镜方法
利用草莓潜隐环斑病毒抗血清富集植物材料中的病毒，在透视电子显微镜下观察病毒颗粒的形态特征，具体操作步骤按照SN/T1840规定进行.如观察到直径为30nm的球状病毒粒子，即可判定免疫电镜结果阳性.
8结果判定
8.1样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阴性，判定该样品不携带草莓潜隐环斑病毒.8.2样品经DAS-ELISA检测为阳性，如果RT-PCR结果阳性，且序列测定结果证实与所检测的草莓8.3样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阳性，经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄 潜隐环斑病毒一致：或者经实时荧光RT-PCR检测为阳性时，可判定样品携带草莓潜隐环斑病毒.主植物出现相应的症状时，可判定样品携带草莓潜隐环斑病毒.
9样品保存与记录结果
9.1样品保存：经检测确定携带草莓潜隐环斑病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核.如种子保存在干燥室温环境中：种苗、鳞球茎等样品保存在一80C冰箱中，做好登记和标记工作.样品保存期限至少1年.
