中华人民共和国国家标准
GB/T28981-2012
Detection and identification of odontoglossum ringspot virus
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：闻伟刚、陈先锋、杨翠云、郭立新、鲁洁、张永江、张明哲、徐瑛、崔俊霞、张慧雨.
齿兰环斑病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了齿兰环斑病毒血清学和分子生物学特征的检测方法.
本标准适用于种子、种球、花卉和种苗等植物材料中齿兰环斑病毒的检测，也适用于蚜虫等传插媒介中该病毒的检测.
2齿兰环斑病毒基本信息
中文名：齿兰环斑病毒学名：odontoglossum ringspot virus缩写：ORSV
属烟草花叶病毒属（Tobamovirus），齿兰环斑病毒其他信息参见附录A.
3方法原理
利用基于抗原抗体反应的双抗夹心酵联免疫吸附测定（Double antibody sandwich enzyme-linkedtranscription polymerase chain reaction，RT-PCR）、实时荧光反转录聚合酶链式反应（real-time immunosorbent assay，DAS-ELISA）、体外DNA合成技术的反转录聚合酶链式反应（Reversefluorescent RT-PCR）进行检测鉴定.
4仪器设备、用具和试剂
4.1仪器设备
PCR仪、实时荧光PCR仪、超净工作台、电子天平（感量：0.001g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、高速冷冻离心机、超低温冰箱（一80C）、高压灭菌锅、小型食品加工机、微波炉、酶标仪.
4.2用具
RNase 离心管、PCR管和研钵等. 可调式微量移液器（2L、10L、100gL、200pL、1 000pL、5000L）及相应的无RNase吸头、无
4.3试剂
主要试剂和缓冲液见附录B和附录C.
5检测
5.1样品制备
取0.5g~10g种子、种球鳞片或畸形、变色症状的叶片等植物组织，在研钵或小型食品加工机中
充分研磨，取五分之一量的均匀后样品，转人离心管中，按1：10（质量：体积）加人样品提取缓冲液振荡混匀.媒介昆虫按1：10（质量体积）加人样品提取缓冲液研磨混匀.2000g离心10min，上清液即为DAS-ELISA、RT-PCR和实时荧光 RT-PCR检测粗提液.
注：提取液在3h内使用，否期保存在4C条件下.
5.2检测方法
5.2.1双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）
DAS-ELISA检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染ORSV的植物组织作阳性对照，用样品提取缓冲液作空白对照，其中，阴性对照材料应该尽量与所检测样品一致.
具体操作步骤见附录B，当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作.
5.2.2RT-PCR方法
RT-PCR检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染ORSV的植物组织作阳性对照，用ddHO作空自对照.
具体操作步骤见附录C.当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作.
5.2.3实时荧光RT-PCR方法
实时RT-PCR检测应设置对照，用健康的植物组织作阴性对照，用感染ORSV的植物组织作阳性对照，用ddH：O作空白对照.
具体操作步骤见附录D，当使用商品化检测试剂盒时，参照试剂盒使用说明进行操作.
6结果判定
样品经DAS-ELISA与RT-PCR检测，结果均呈阳性，可判定样品携带齿兰环斑病毒. 样品经DAS-ELISA与实时荧光RT-PCR检测，结果均呈阳性，可判定样品携带齿兰环斑病毒.
7样品保存与记录
7.1样品保存
经检测确定携带齿兰环斑病毒的样品保存在一80C冰箱中，并做好登记和标记工作.样品保存期限至少1年.
7.2结果记录与资料保存
需有酶联反应吸光值的原始数据，RT-PCR检测需有电泳结果图片，实时荧光PCR需要有荧光曲线图 完整的实验记录包括：样品的来源、名称、唯一性标识、检测时间、地点、方法和结果等.血清学测定与Ct值.结果记录与资料保存期限至少1年.
附录A
A.1名称
中文名：齿兰环斑病毒学名：odontoglossum ringspot virus缩写：ORSV分类地位：烟草花叶病毒属（Tobamovirus）.
A.2寄主范围
主要寄主是建兰（Cymbidium ensifolium）、蝴媒兰（Phalaeanopsis sp.）、文心兰（Oncidiam sp.）等兰科（Orchidaceae）植物.
A.3为害症状
感染了ORSV的兰花，叶片常产生黄化条纹或不规则褪绿色斑块，花部甚至出现畸形或褪色斑，红色系花朵尤为明显.
A.4分布地区
在世界各地均有分布.
A.5传播方式
可通过无性繁殖材料、机械操作携带汁液、蚜虫等传播，
A.6粒体形态
长约300nm，宽约18nm的杆状病毒，颗粒中输可清楚分辨，部分病毒头尾相连.
A.7基因组
ORSV粒体分散在细胞质内基晶格排列.内含体为X一体病毒基因组6395nt.沉降系数211.6S，核酸为单链RNA，相对分子质量2X10.
