中华人民共和国国家标准
GB/T30955-2014
饲料中黄曲霉毒素B、B2、G、G2的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法
Determination of aflatoxin B BG Gcontent in feedsHigh performance liquid chromatography with immunoaffinity column clean-up
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准起草单位：浙江大学饲料科学研究所、中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所[国家何料质量监督检验中心（北京）、北京中检维康技术有限公司.
饲料中黄曲霉毒素B、B、G、G的测定 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法
1范围
方法，
本标准适用于饲料中黄曲霉毒素B、B、G、G：的测定
本标准的检测限：黄曲霉毒素B为0.2μg/kg，黄曲霉毒素B:为0.2μg/kg，黄曲霉毒素G为0.3pg/kg，黄曲霉毒素G:为0.3μg/kg.
本标准的定量限：黄曲霉毒素B，为1.0ug/kg，黄曲霉毒素B：为1.0μg/kg，黄曲霉毒素G为1.0μg/kg，黄曲霉毒素G为 1.0μg/kg
2规范性引用文件
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T14699.1何料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备
3原理
析柱层析净化，经高效液相色谱仅分离，荧光检测器柱后光化学衍生测定黄曲霉毒素B、B、G、G：的 试样经过甲醇-水提取后，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层含量.
4试剂
除非另有说明，均为分析纯的试剂：实验室用水符合GB/T6682中二级用水规定，标准溶液和流动相用水符合一级用水规定.
4.2苯：色谱纯. 4.1甲醇：色谱纯.4.3乙腩：色谱纯.4.5甲醇水（4555）：取45mL甲醇（4.1）加55mL水，混合均匀.4.6苯乙晴（982）：取2mL乙晴（4.3）加人98mL苯（4.2），混合均匀.B、B、G、G标准储备液，保存于4C备用，可使用1年.4.8黄曲霉毒素混合标准工作液：准确移取适量的黄曲霉毒素B、B、G、G：标准储备溶液（4.7），
50C下，氮气吹干仪欧干，用适量的甲醇水（4555）溶液（4.5）定容为混合标准工作液，黄曲霉毒素BB;G;、G各分别为 0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL4.9PBS缓冲溶液：称取8.0g氯化钠，1.2g磷酸氢二钠，0.2g磷酸二氢钾，0.2g氯化钾，用990mL 纯水溶解，然后用浓盐酸调节pH值至7.0，最后用纯水稀释至1000mL.
4.10次氯酸钠.
5仪器和设备
实验室常规仪器、设备、材料及下列各项.5.1高速均质器，18000r/min~22000r/min，或震荡器.5.2黄曲霉毒素免疫亲和柱，柱容量≥300ng.5.3玻璃纤维滤纸，直径11cm.孔径1.5pm.5.5氮吹仪，50℃， 5.4玻璃定量管，10mL.5.6光化学衍生系统.5.7高效液相色谱仪，带荧光检测器.
6试样采集与制备
按GB/T14699.1采样：按GB/T20195用四分法缩减至500g，粉碎后过1mm孔径的分析筛，混匀后装人密闭容器，冷藏保存.
7分析步骤
7.1提取
称取试样（粒度小于1mm）50.0g于250mL具塞锥形瓶中.加人5.0g氯化钠及准确加入100.0mL（V）甲醇水（82）溶液（4.4），以均质器高速揽拌提取2min，或震荡器震荡30min.定量滤纸过滤，准确移取10.0mL（V）滤液并加人40.0mL（V ）PBS缓冲溶液（4.9）稀释，用玻璃纤维滤纸过滤1~2次，至 滤液澄清，备用.
7.2净化
将免疫亲和柱连接于10.0mL玻璃定量管下.准确移取10.0mL（V）样品提取液注人玻璃定量管中，将空气压力泵与玻璃定量管连接，调节压力使溶液以不超过2mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱， 待溶液全部流出后，以10.0mL纯水清洗柱子2次，弃去全部流出液.准确加人1.0mL（V）甲醇（4.1)洗脱，流速不超过1mL/min，收集全部洗脱液于玻璃试管中，加纯水定容为2.0ml，供色谱检测用.
7.3测定
7.3.1色谱条件
色谱柱：C柱，长150mm，内径4.6mm，填料直径5pm，或相当者.流动相：甲醇水（4555）溶液（4.5） 流速：0.8ml/min.
检测波长：激发波长360nm：发射波长440nm
光化学衍生系统，进样量：20L 柱温：30℃.
7.3.2色谱测定
分别取相同体积样液和标准工作溶液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值（峰高或峰面积）.经过与黄曲霉毒素B、B、G、G：标准溶液谱图比较响应值得到试样中黄曲霉毒素B、B、G、G的浓度c（μg/L).标准品色谱图参见附录A.
警告一一黄曲霉毒素是高致癌性物质，应十分小心处理.使用过的玻璃容器及黄曲霉毒素溶液用5%浓度次氯酸钠溶液浸泡过夜.
8结果计算与表述
8.1结果计算
试样中黄曲霉毒素B、B、G、G：含量以质量分数X，计，单位为微克每千克（μg/kg），按式（1）计算：
式中：
P.-试样溶液中黄曲霉毒素B、B、G、G各组分的峰面积值；V：样品的总稀释体积，单位为毫升（mL）；V.-标准溶液的进样体积（pL)； c 黄曲霉毒素B、B、G、G：各标准溶液浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；P-黄曲霉毒素B、B、G、G：各标准溶液峰面积平均值；m试样质量，单位为克（g).
8.2结果表示
测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果表示到小数点后一位.
9重复性
在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不大于其算术平均值的15%.
