中华人民共和国国家标准
GB/T30988-2014
Methods of genomic DNA extraction from plants with high levels of polyphenols
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
目 次
前言1范围3缩略语 2规范性引用文件4原理5实验室通用要求6试剂与溶液7仪器和设备8提取步骤9DNA纯度、浓度测试
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.本标准由中国测试技术研究院提出. 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）归口.本标准起草单位：中国测试技术研究院、中测测试科技有限公司.本标准主要起草人：谭和平、沈兴中、唐祥凯、周李华、孙登峰.
多酚类植物基因组DNA提取纯化 及测试方法
1范围
方法， 本标准规定了以茶树为代表的多酚类植物基因组DNA提取纯化方法以及DNA纯度、浓度测试
本标准适用于茶树、马铃薯、樱桃、葡萄以及其他富含多酚类的植物的植物基因组DNA提取及纯化.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682-2008分析实验室用水规格和实验方法
GB/T19495.3-2004转基因产品检测核酸提取纯化方法
Tris:三（羟甲基）氨基甲烷 下列缩略语适用于本文件.SDS：十二烷基磺酸钠PVP：聚乙烯毗咯烷酮RNase A:核糖核酸酶AFF：二甲苯青 EDTA：乙二胺四乙酸TE：三（羟甲基）氨基甲烷-乙二胺四乙酸
4原理
4.1提取纯化
化褐变，同时利用聚乙烯毗略烷酮（PVP）的粘接性去除多酚类化合物及其他次生代谢物等杂质，然后利 在液氮条件中，通过物理研磨方法破碎多酚类植物叶片的细胞，利用抗氧化剂防止多酚类化合物氧用化学方法使DNA从植物细胞中释放出来，再弃除DNA中的蛋白质等杂质，以及DNA提取过程中加人的异戊醇、异丙醇、乙醇等有机溶剂，最后得到纯的DNA.
4.2纯度测试
在pH 7~8.5下，根据DNA在260nm处有吸收高峰，蛋白质在280nm处有吸收高峰，硫氰酸盐、碳水化合物（糖类）在230nm处有吸收高峰，酚类物质在270nm处有吸收高峰的特性，利用A:c/A、
A/A、A/A的比值来评估DNA样品的纯度，然后利用A=1相当于50μg/mL的双链DNA来计算DNA的浓度.
过观察DNA条带是否单一、清晰、明亮来评估DNA样品的纯度. 利用荧光染料（如溴化乙啶）可与琼脂糖凝胶中的DNA嵌合，在紫外源激发下发出荧光的特性，通
5实验室通用要求
按照GB/T19495.3-2004第4章中实验室通用要求的规定执行.
6试剂与溶液
6.1本标准所使用的水均为一级水，符合GB/T6682一2008的要求.除非另有说明，在分析中仅使用0.22um膜过滤除菌：酶溶液应避免反复冻融. 分析纯试剂，试剂溶液宜大体积配制、小体积分装后经高压灭菌后使用，不宜高压灭菌的试剂应用6.2葡萄糖（glucose，CH;O）.6.3焦亚硫酸钠（sodium pyrosulfite，NaSO）6.4聚乙烯吡咯烷酮[polyvinylpyrrolidone，PVP，（CH NO）.]. 6.5β-硫基乙醇(β-mercaptoethanol HOCH CHSH).6.6十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate SDS，CH:O SN).6.7乙胺四乙酸钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium saltNa;EDTAC H NO Na).6.8三(羟甲基)氨基甲烷[tris （hydroxymethyl)methyl aminomethane Tris C HNO].6.9无水乙醇（alcohol CH;OH)，4C保存及使用. 6.10氯化钠（sodiumchloride，NaCl).6.11三氯甲烷（chloroform，CHCl）.6.12异丙醇[isopropyl alcohol，CH CH(OH)CH，].6.14乙酸钠（sodium acetate，NaAc）溶液：3mol/L，用乙酸调pH至5.2，不要高压灭菌（0.22μm膜过 6.13异戊醇[isoamyl alcohol (CH);CHCHCHOH].滤）.6.15氯仿：异戊醇乙醇溶液（80：4：16）6.16 DNA 提取液 I :100 mmol/L Tris-Cl 20 mmol/L EDTA 500 mmol/L NaCI 1.5% SDS.6.17DNA 提取液Ⅱ：18.6 g葡萄糖，6.9 gNaS:O，6.0g PVP 240μL β-硫基乙醇，加水至300 mL. 6.18TE 缓冲液(pH 8.0)：10 mmol/L Tris-Cl 1 mmol/L EDTA 使用 HCI或 NaOH 调节 pH.6.19RNaseA酶溶液：10mg/mL，-20C保存，避免反复冻融.6.2070%乙醇溶液：4℃保存及使用.6.2110×上样缓冲液：含0.25%澳酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油水溶液.
7仪器和设备
7.1冷冻研磨机（样品冷冻，研磨都处于液氮条件下）.7.2离心机（可以在4℃下进行离心，离心转速10000r/min以上）.7.3水浴锅（工作范围60℃~70℃） 7.4涡旋器.7.5平板电泳仪.2
