中华人民共和国国家标准
GB/T31792-2015
Detection and identification of Diaporthehelianthi Muntanola-CvetkovicMihaljcevic et Petrov
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国合格评定国家认可中心、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：吴品珊、杜洪忠、蔡露敏、张祥林、严进.
向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了向日募茎溃疡病菌的检疫鉴定方法.本标准适用于向日葵植株和种子中向日葵茎溃疡病菌的检疫和鉴定.
2仅器和用具
2.1仪器
体视显微镜、生物显微镜、超净工作台、光照培养箱、电子天平（1/1000g）、高压灭菌锅、冰箱、PCR扩增仪、荧光PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅.
2.2用具
移液器、移液器吸头、离心管、液氮罐、样品筛（10目，p1.7mm）. 烧杯、三角瓶、量筒、试管、培养Ⅲ、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、塑料研、
3试剂和培养基
3.1试剂
NaOAc，KCl，Tris，CTAB，TAE，无水乙醇（Ethanol），三氯甲烷（Chloroform），异丙醇（Isopropanol），异 葡萄糖，链霉素，乳酸，琼脂，1.0%次氯酸钠（NaCIO）.液氮，Tris-HCl.MgCI，HCI，EDTA，NaOH，戊醇（Isoamylalcohol) SYBR GreenI核酸染料，蛋白酶K，Taq DNA聚合酶，dNTP，通用引物 ITS5和ITS4，实时荧光PCR特异性引物DH-F、DH-R及探针DH-Pr.
3.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），链霉素马铃薯葡萄糖琼脂培养基（SPDA）.具体配方参见附录A
4检疫鉴定方法
4.1症状检查
采集田间疑似症状的茎杆、病叶或葵盘，剪取病健交界处的组织材料备用.病害典型的症状是茎杆和叶柄处有淡褐色溃疡病斑，详见附录A病害症状描述.
在种子中挑选干、变色、皱缩、残缺或霉变的种子，同时挑选其中夹带的向日葵残体，如叶柄、茎杆、花盘碎片等.
4.2分离培养
将有疑似症状的叶片、叶柄、茎杆、花盘碎片等样品在病健交界处剪取5mm~10mm的小块.用
1%次氯酸钠表面消毒5min~10min，灭菌水冲洗3次，用灭菌滤纸将水吸干后，置于含链霉素的SPDA培养基平Ⅲ中，25℃、8h光照/16h黑暗条件下培养，3d~5d后开始观察.
下故置24h，再在-20℃下冷冻24h.然后转至含链霉素的SPDA培养基平m中，25℃、8h光照/16h 将种子样品用1%次氯酸钠表面消毒5min~10min，灭菌水冲洗3次，保持无菌状态，在室温25℃黑暗条件下培养，3d~5d后开始观察.
有种衣剂的种子，先将种衣剂洗掉（参见附录A），再进行上述操作.
4.3生物学鉴定
如在SPDA培养基上观察到真菌菌落，转接到PDA培养基平Ⅲ上纯化培养，5d~7d后开始观察记录病菌的培养性状，显微镜下观察记录分生孢子和分生孢子器的形态和大小.
4.4分子生物学检测
4.4.1DNA提取
收集分离到的真菌菌丝，采用CTAB方法提取DNA（参见附录B）.
4.4.2实时荧光PCR检测
实时荧光PCR引物序列为DH-F：5'-CGCTTATCTCTTACACCAAAACCCT-3，DH-R：5′-GCAGCTATTGAAACAGCTCATCTG-3′ TaqMan 探针 DH-Pr: 5'-FAM-ATGCACCCA CCGCA CTCCTGC-BHQ-1-3'，探针5'端标记的荧光报告基团为FAM，3端标记的荧光猝灭基团为BHQ-1.
反应体系(25L):样品 DNA 1 pL 10×PCR 缓冲液 2.5L25 mmol/L MgCl 2 pL 2.5 mmol/LdNTPs 2 μL 10 μmol/L Primers 各 1 μL 10 μmol/L 探针 DH-Pr 1.5 μL 5 U/μL Taq DNA 聚合酶0.3pL，ddH：O13.7pL.以无菌双蒸水作空白对照，阳性对照以向日葵茎溃疡病菌DNA为模板，阴性 对照以向日葵上其他真菌DNA为模板.
反应循环为：94℃10min；94℃15s.56℃60s，40个循环.
4.4.3ITS基因检测和序列比对
可以选择利用真菌通用引物PCR扩增后测序比对的分子方法.
可利用真菌通用 引物 ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3')和 ITS4(5'-TCCTC-CGCTTATTGATATGC-3'）进行扩增.
25 μL 反应体系(25μL):样品 DNA 1 μL(1 ng~50 ng)，10×PCR缓冲液 2.5 μL 25 mmol/L0.2pL ddHO16.3gL.同时设置阴性对照，以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品. MgCl; 2 μL 2.5 mmol/L dNTPs 2 yL 10 μmol/L Primers 各 0.5 yL 5 U/pμL Taq DNA 聚合酶
PCR反应条件为：94C 4 min;95℃ 1 min 、56℃ 30 s、72C 45 s 35个循环；72C 10 min;4 ℃保存.
5V/cm，凝胶成像仪分析结果.如有500bp左右大小的条带出现将扩增产物进行序列测定. PCR产物的检测在1×TAE电泳缓冲液中，1.5%琼脂糖（含SYBRGreenI核酸染料）凝胶电泳，
将测序后的序列与 NCBI 网站 GenBank 中公开发表的 Diaporthe helianthi 的序列进行 BLAST分析.
5签定特征
5.1培养性状
向日葵茎溃疡病菌在PDA培养基上生长，菌落初期为白色，菌丝体较密集，两周后渐渐变为褐色
至深褐色，其间形成暗褐色分生孢子器，菌落形态图参见附录C.
5.2病菌形态
向日葵茎溃疡病菌的菌丝分隔，分生孢子器聚生或散生，浅褐色、褐色至黑色，球形或肩球形，直径120μm~450μm，含有α和β两种类型的分生孢子.a分生孢子无色、单胞，纺锤形或椭圆形，常有2个~4个油滴，大小为（8jm~21μm）×（1.7xm~5.5pm）；β分生孢子无色、单胞，丝状线形，一端常为钩状，无油球，大小（16μm~42μm）×（0.5μm~6.9μm）.
600μm:子囊无色，大小（44μm~67μcm）×（7.5μm~12.5μm），含8个子囊孢子；子囊孢子双胞、无色、 病菌在植物残体上形成有性器官.子囊壳直径350ym～450pm，有喙状突起长350μm~椭圆形，大小（12.5μm~19μm）×（2.8μm~7.5μm).
向日葵茎溃疡病菌的型分生孢子、β型分生孢子的形态图参见附录C.
5.3实时荧光PCR检测
在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下：
Ct值小于或等于36，判定阳性；一Ct值大于或等于40，判定阴性；一Ct值在36~40之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后如Ct值小于或等于36，或者C值大 于或等于40，判定同上.
5.4ITS序列比对
经BLAST分析，PCR扩增到的 ITS 基因序列与NCBI网站GenBank 中登录号为FJ841862.1的Diaporthe helianthi 的序列同源性为 99%~100%，则判定为阳性.
6结果判定
病菌的培养性状和形态特征与5.1和5.2的描述一致，且实时荧光PCR检测结果呈阳性，或ITS序列比对99%～100%同源，可判定为向日葵茎溃疡病菌.
7样品保存与处理
备复核.该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理. 样品经登记和经手人签字后妥善保存.对检出向日葵茎溃疡病菌的样品应保存于4℃冰箱中，以
8菌株保存与处理
斜面上，20℃培养5d，4℃～8℃黑暗条件下保存，定期（60d）转接，至少保存6个月，必要时用病菌 从检测样品中分离并鉴定为向日葵茎溃疡病菌的菌株，应妥善保存，将菌株接种于PDA培养基的分生孢子作冻干菌种保存.保存期满后高压灭菌灭活处理.
9结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字，
