中华人民共和国国家标准
GB/T31793-2015
Detection and identification of Leptosphaeria maculans (Fuckel） Ces.et De Not.
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草. 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局.本标准主要起草人：吴品珊、易建平、周国梁、杜洪忠.
油菜茎基溃疡病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了油菜茎基溃疡病菌的检疫鉴定方法.
本标准适用于油菜和油菜茎基溃疡病菌其他十字花科寄主种子和植株中油菜茎基渍疡病菌的检疫和鉴定.
2仪器和用具
2.1仪器
电子天平（感量0.01g）、生物显微镜、体视显微镜、高速冷冻离心机、纯水仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、实时荧光PCR仪、培养箱、冰箱.
2.2用具
烧杯、三角瓶、量筒、培养Ⅲ、酒精灯、镊子、剪刀、解剖刀、接种针、载玻片、盖玻片、研钵、移液器、移液器吸头离心管、液氮罐、孔径2.5mm和1.5mm的网筛.
3试剂和培养基
3.1试剂
1.0%次氯酸钠（NaCIO），琼脂粉，马铃薯，葡萄糖，乳酸，琼脂糖，无菌双蒸水，液氮，蛋白陈，磷酸二氢钾，硫酸镁，链霉素，新霉素，五氯硝基苯，氯四环素，利福平，Tris-HCI，MgCL，HCI，EDTA，NaOH，NaOAc，KC1，Tris，CTAB，TAE，无水乙醇（ethanol），苯酚（phenol），溴化乙锭（EB），三氯甲烷（chloroform)异丙醇（isopropanol)，异戊醇(isoamyl alcohol)，蛋白酶K，Taq DNA聚合酶，dNTP DNA 相对 分子质量标准物.PCR特异性引物和实时荧光PCR特异性引物及探针.
3.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），酸性马铃薯葡萄糖琼脂培养基（APDA）.具体配方参见附录A
4检疫签定方法
4.1种子检测
未带有种衣剂的种子，解剖镜下挑取皱缩、干巍、变色、畸形、残缺或有霉变的种子1g～2g：带有种衣剂的种子，先用自来水浸泡洗去种衣剂，或用纱布包裹浸泡搓洗种子，自来水冲洗去种衣剂，待风干后挑取异常种子做分离培养.
商用油菜籽样品取1kg，用孔径2.5mm和1.5mm的网筛过筛，孔径2.5mm筛上物多为豆英和茎等植株残体，孔径1.5mm筛下物多为碎屑和细小油菜籽.筛上物和筛下物混匀后，取1g~2g制样，进行PCR初检，初检如果阳性、再挑取异常种子做分离培养.
4.2植株症状检查
检查植物的根、蒸和叶片等部位，对茎部溃疡黑斑、根部变色黑腐、叶上有灰色斑点的植物，取样送实验室做进一步检验，油菜茎基溃疡病菌为害症状参见附录A.
4.3分离培养
种子样品用无菌水室温浸泡0.5h~1h：无菌水洗涤3次后加人无菌水浸泡，置于20℃~25C培养1d；无菌水洗涤3次后转人-20C下冷冻处理过夜：1%次氯酸钠消毒10min，无菌水3次洗涤后置于APDA培养基上，30粒/Ⅲ~40粒/Ⅲ：20C下黑暗培养10d.
取可疑症状的根、茎、叶的病健交界处，剪成5mm×5mm小块，1%的次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水冲洗3次，吸干水分，置APDA培养基上，20C下黑暗培养10d.
4.4形态学鉴定
上，20℃下黑暗纯化培养，5d~7d后开始观察记录病菌的培养性状，显微镜下观察记录分生孢子和分 在APD培养基上，从第3天开始观察分离样品周围是否有菌丝产生，挑出菌丝转接到PDA培养基生孢子器的形态和大小.
4.5分子生物学鉴定
4.5.1DNA提取
将制备的商用油菜籽初检样品用液氮研磨后，取样0.1g~0.2g，采用CTAB方法提取DNA（参见附录B).
提取DNA（参见附录B）. 将分离到的真菌菌丝收集，放入1.5mL浸在液氮里的离心管中，用塑料碾碎，采用CTAB方法
4.5.2PCR 检测
常规PCR方法一：特异性引物Lm3（5'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3'）和Lm4（5'-AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3’).PCR 反应总体积为 30 μL 包含 10 mmol/L Tris-HCI 50 mmol/L KC1(pH 8.3) 2.5 mmol/L MgCl dATP dGTP、dCTP dTTP 浓度均为100μmol/L 引物浓度各为100 nmol/L，2 μL 模板 DNA，1.5 U Taq DNA 聚合酶.反应循环程序为：94℃C 3 min:94C 30 s，67 ℃C30s 72℃30s 35个循环：最后72℃5min取10yL扩增产物与3μL的6×上样缓冲液混匀，在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中，4V/cm~6V/cm电泳30min，溴化乙锭（EB）染色后在成像系统中成像分析，
（5'-GCAAAATGTGCTGCGCTCCAGG-3'）.PCR反应总体积为30μL，包含10mmol/LTris-HCl， 常规PCR方法二：特异性引物LmacF（5'CTTGCCCACCAATTGGATCCCCTA-3）和LmacR50 mmol/L KCI pH8.3) 2.5 mmol/L MgCl; dATP、dGTP、dCTP、dTTP 浓度均为 100 μmol/L 引物浓度各为100nmol/L，2μL模板DNA 1.5U TagDNA聚合酶.反应循环程序为：94C3min;94℃30s63℃30s，72℃40s，35个循环：最后72℃5min.取10L扩增产物与3pL的6×上样缓冲液混匀，在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中，4V/cm~6V/cm电泳30min，澳化乙锭（EB）染色后在 成像系统中成像分析.
套式PCR：第轮扩增引物 Lm2（5'-TCAGTGGCGGCAGTCTACTT-3′）和Lm6（5′-GCCGGCTGCCAATTGTTTCA-3′)， 第二轮扩增引物 Lm3(5′-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3′>和 Lm4(5′-
AGGCGAGTCCCAAGTGGAACA-3′).PCR 反应总体积为 30 pL 包含 10 mmol/L Tris-HCl 50 mmol/L KCI(pH 8.3) 1.5 mmol/L MgCl dATP 、dGTP dCTP、dTTP 浓度均为 100 μmol/L 引物浓度各为100nmol/L，模板DNA为2μL.1.5U TagDNA聚合酶.反应循环程序为94C3min;94C30s 67C（引物Lm2/6为60C）30s 72℃30s，35个循环（引物Lm2/Lm6第一轮扩增25个 循环）；最后72℃5min.第一轮扩增产物1μL用作第二轮扩增的模板.取10μL扩增产物与3μL的6×上样缓冲液混匀，在1.5%琼脂糖凝胶1×TAE缓冲液中，4V/cm~6V/cm电泳30min，溴化乙锭（EB）染色后在成像系统中成像分析.
实时荧光 PCR：引1物Lm3（5'-GCCCACCAATTGGATCCCCTA-3)/R2（5'GGCGCAAAATGTGCTGCGCT-3’)，探针Probe-M（5′-FAM-CACTTGGGACTCGC-MGB-3’）.PCR反应体系为 25μL，包括 12.5pl 2×Premix ExTaq、上下游引物（5mol/L）和探针（5μmol/L）各1μL、2yL模板DNA0.5μL 50×ROX Reference DyeIl，加无菌水补至25 yL.反应程序为：95℃10 s;95℃ 15 s60℃ 1 min.40个循环.
5签定特征
5.1病菌形态
初生菌丝无色，有分隔；菌丝呈白色放射状，初期可见结节状菌丝结，后期菌丝结形成黑色至褐色分生孢子器：分生孢子器球形至扇球形，褐色至深黑褐色，散生、埋生或半埋生于菌丝中，直径100μm~400pm，顶部具孔口，周围有浅粉色、红色或紫色的黏性分生孢子团溢出，内含大量的分生孢子：分生孢子无色透明，椭圆形至纺锤形内含2个油球孢子大小（3.3μcm~6.1pm）×（1.4μm~2.4μm）.
棍棒形到圆柱形，双层壁，大小（70μm~120μm）×（10μm~17μm），内含8个双列的子囊孢子；子囊 假囊壳在感病的木质化部位上产生，黑色，球形，理生或爆裂，具孔口，直径360um～500gm；子囊孢子长椭圆形，黄福色，具5个隔膜，大小（30μm~70μm）×（4μm~9μm）.人工培养条件下未见有性型的形成.
病菌形态图参见附录C中图C.1.与其近似种的形态比较参见附录D中表D.1.
5.2PCR 检测
如常规PCR引物Lm3/Lm4扩增产物为279bp，或引物LmacF/LmacR扩增产物为331bp，视为油菜茎基溃疡病菌阳性.
如套式PCR引物Lm2/Lm6和Lm3/Lm4扩增产物为279bp.视为油菜茎基溃疡病菌阳性.
实时荧光PCR检测，在阳性对照、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下：
Ct值小于或等于36.判定油菜茎基溃疡病菌阳性；Ct值大于或等于40，判定油菜茎基溃疡病菌阴性；Ct值在36~40之间，应重做实时荧光PCR，再次扩增后如C值小于或等于36，或者C值大于或等于40，判定同上.
6结果判定
分离菌形态特征与5.1描述一致，且常规PCR、套式PCR或实时荧光PCR检测为阳性，可判定为油菜茎基溃疡病菌（Leprosphaeria macalans）.
