中华人民共和国国家标准
GB/T31807-2015
Detection and identification of Phymatotrichopsis omnivora （Duggar）Hennebert
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口. 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国珠海出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院.本标准主要起草人：张慧丽、张卫东、段维军、徐瑛、陈先锋、崔俊霞、杜洪忠、吴品珊.
棉花根腐病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了棉花根腐病菌的检疫鉴定方法.本标准适用于棉花根腐病寄主植物的植株、种子及介质的检疫鉴定.
2仪器设备和主要试剂
2.1仪器设备
显微镜、解剖镜、天平（感量1/100g-1/10000g）、pH计、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、台式离心机、高速冷冻离心机、低温冰箱、冷藏冷冻冰箱、超净工作台、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、微量移液器（2μL 20μL、100L 200μL、1 000zL).
2.2主要试剂
除另有规定外，试剂均采用分析纯.包括无菌双蒸水、次氯酸钠、液氮、蛋白酶K、氯化镁、氢氧化钠、醋酸铵、氯化钾、无水乙醇、澳化乙锭、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、TaqDNA聚合酶、dNTP混合物、10XPCR缓冲液、琼脂糖、DNA相对分子质量标准物、CTAB、Tris/EDTA/SDS提取缓冲液（TES）、Tris硼酸盐EDTA缓冲液（TBE）、Tris/EDTA缓冲液（TE）等.分离培养基、产孢培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）配制方法及步骤见附录C.
3病菌的鉴定
3.1症状检查
将可疑植株的根部在解剖镜下镜检，将带有菌丝索或菌核的病根挑出，种子类样品，从中挑选夹带的植株残体，尤其是根部病残体.介质土借助湿筛挑出其中的菌核（参见附录B）.
3.2病原菌的分离培养
3.2.1病根上菌丝索的分离培养
在解剖镜下，将病根上覆盖的菌丝索挑下，用无菌水洗涤菌丝片段，洗净后置于分离培养基上，28℃黑暗培养，每天观察，待长出菌丝后，挑取菌丝尖端转移到PDA平板上纯化.
3.2.2病残体上病原菌的分离培养
在自来水下将病残体洗净，切取病健交界处组织，用1%次氯酸钠进行表面消毒3min，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干表面水分后、置于分离培养基上，28℃黑暗培养，每天观察，待长出菌丝后，挑取菌丝尖端转移到PDA平板上纯化，
3.2.3菌核上病原菌的分离培养
菌核上病原菌的分离培养方法同3.2.2.
3.3分生孢子的诱导
将纯化好的菌株接种到产孢培养基上，28C，每天光照16h.每天观察，待产孢后，显微镜下观察分生孢子的形态特征.
3.4PCR鉴定方法
PCR鉴定方法见附录D.
4鉴定特征
4.1症状特点
寄主植物受侵染后，根的表面覆盖有棕褐色至金黄色菌丝索（参见B.1)，根部变软、腐烂、皮层易剥落，中柱变色或出现红褐色病班（参见B.1)，有时根表面还可以看到棕色至黑色的菌核.
4.2病菌的形态特征
(12μm~20μm）×（20μm~30μm），少数情况下分生孢子梗呈棍棒状或串珠状，其顶部产生分生孢 病菌在PDA平板上菌落初为白色，后变为污黄色（参见B.2）.分生孢子梗球形或椭圆形，大小子，外观上类似“担子”（参见B.2）.分生孢子单胞，透明，球形或卵圆形，着生于多分枝的菌丝上，直径4.8μm~5.5μm或（6μm~8μm）×（5μm~6μm）（参见B.2）.菌丝索褐色，直径约200μcm，成直角伸出侧枝，侧生菌丝呈十字形分枝（参见B.2）.菌核棕色或黑色，圆形或不规则形，直径1mm~5mm，单生或串生，萌发后长白色菌丝，后变污黄色（参见B.3）.
4.3PCR特异性扩增
P.omniuora 的特异性扩增片段为627bp.
5结果判定
根据棉花根腐病菌的为害症状及病原菌形态特征对病菌分离物进行综合判定，分离物的为害症状及形态特征与第4章各项鉴定指标吻合，判定为棉花根腐病菌，分离物的为害症状及形态特征不明显的情况下，分离物需要进行PCR鉴定，PCR特异性扩增阳性，可判为棉花根腐病菌.
6样品保存与结果记录
6.1样品保存与处理
经检验确定携带棉花根腐病菌的样品，视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月，以备复核.保存期满后，应经灭菌处理.
6.2菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为棉花根腐病菌的菌株，应妥善保存.对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理.
6.3结果记录与资料保存
断时使用的方法（包括质控物质，以及每种方法获得的结果），PCR检测应有电泳结果照片，签定实验室 需要保存的记录包括：样品的种类、自然状态、来源、被为害症状及为害程度（无症状也要说明），诊的名称，负责人和鉴定人的签字等.
