中华人民共和国国家标准
GB/T31809-2015
Detection and identification of Pythium splendens Braun
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院.
本标准主要起草人：张慧围、张建成、顾建锋、郑炜、徐瑛、陈先锋、段维军、陈吴健、吴志毅、杜洪忠、吴品珊.
油棕猝倒病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了油棕猝倒病菌的形态学和分子生物学检疫鉴定方法.本标准适用于油棕猝倒病菌寄主植物的植株、插枝等植物材料及介质的检疫鉴定.
2仪器设备
生物显微镜（具油镜镜头）、具透射光源的体视显微镜（最大放大倍数不低于50×）、高压灭菌锅、天离心机、真空抽干仅、低温冰箱、冷藏冷冻冰箱、超净工作台、普通PCR仪、光学PCR反应管、pH计、电泳仪、水平电泳槽、实时荧光PCR仪、微量移液器（0.5μL、2yL、10pL、20pL、100L、200l、 1000pL）、PCR反应管（0.2mL、0.5mL）、锥形瓶、试管、培养Ⅲ、载玻片、盖玻片.
3主要试剂和培养基
无水乙醇、溴化乙锭、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、氨苄青霉素、利福平、制霉菌素、苯菌灵、氯化钠、 除另有规定外，试剂均采用分析纯.无菌双蒸水、液氮、蛋白酶K、氢氧化钠、醋酸铵、氯化钾、SDS 提取缓冲液（TES）、Tris/EDTA缓冲液（TE）、Tris 硼酸盐 EDTA缓冲液（TBE）等.培养基及缓冲液配制方法见附录B
4检疫签定
4.1症状检查
仔细检查根部，根部症状是软化变褐，腐烂：茎部症状是出现灰色或棕黑色水渍状斑点（参见附录A）.对可疑植物和繁殖材料的介质土应取样做进一步检验.
4.2组织分离
选萎蒿及根部变褐但没有完全腐烂的植物材料，用流动的自来水冲洗干净，在根茎病健交界处切取0.5cm×0.5cm的小块组织，用1%次氯酸钠进行表面消毒3min，无菌水冲洗3次，灭菌滤纸吸干表面水分后，置于选择性培养基上，25℃～30C黑暗培养，每天观察，待长出菌丝后，挑取菌丝尖端转移到 基础培养基上纯化，保存备用.
4.3土壤诱集
作为诱饵，取5g~20g土壤样品研磨破碎放人50mL灭菌洁净烧杯中，厚度不超过2cm，缓慢加人无 对禾本科植物叶片（如：马唐、狗尾草、稗草等）进行高温高压灭菌处理，剪成直径1cm大小的小片菌水没过土表1cm~2cm，用吸水纸轻轻去掉形成的表面膜和漂浮的有机物残渣，每烧杯水面放置诱饵10片左右.静置过夜，体式显微镜下观察，将有菌丝体长出的诱饵取出，用无菌水洗净表面，无菌吸
水纸吸干，放人选择性培养基平板上培养，待长出菌落后镜检，菌丝体呈棉絮状，分枝，无隔多核，挑取菌丝尖端转移到基础培养基上纯化，保存备用.
4.4培养物观察
得到病菌纯培养物后，挑出菌丝制片.用解剖针将菌丝尽量展开，观察病菌特征.需测量不少于30个菌丝膨大体大小，计算平均值.
4.5PCR签定方法
PCR鉴定方法见附录C.
5签定特征
5.1培养性状
在基础培养基上菌落边缘整齐，气生菌丝发达，蛛丝状.
5.2形态特征
5.2.1菌丝和菌丝体
菌丝不规则分枝，菌丝宽3.5μm~9.2μm，平均6.4μm，培养基上菌丝膨大体丰富，叶片诱集可产生大量菌丝膨大体.菌丝膨大体（参见附录A）球形至近球形，光滑，通常顶生，很少间生，直径25pmm~49pm，在异宗配合腐霉中油棕猝倒病菌的菌丝膨大体直径最大，平均38um，其余种菌丝膨大体平均直径小于30μm，菌丝膨大体内充满颗粒状原生质，菌丝膨大体需在有水的情况下经数小时萌发，萌发时每个膨大体产生1个～6个芽管，不产生游动孢子囊和游动孢子，
5.2.2有性生殖阶段特征
有性繁殖为异宗配合，但有些分离物单培养也可以形成藏卵器，藏卵器也可以出现在老化的培养物或培养数年的菌株上.藏卵器顶生或间生，球形，器壁光滑、薄，直径24μm~38μm.雄器异丝生，顶胞大，通常20μm×15μm，直或颈状弯曲.卵孢子游离在藏卵器内，不满器，与藏卵器的比例为1：1.2， 生，偶尔间生，每个藏卵器1个～8个雄器，柄有时分支或分叉，多个雄器同时围绕一个藏卵器，雄器细直径20μm~33zm，壁光滑，薄，壁厚1μm~2pm（参见附录A）.
6结果判定
以油棕猝倒病菌在寄主上的症状、分离物的培养特征、无性及有性世代阶段特征等作为鉴定依据，进行综合判定.若以上特征与第5章鉴定特征吻合，则鉴定为油棕猝倒病菌，若菌丝膨大体平均值小于38μm，应进行分子鉴定，分子鉴定结果为阳性，可判定为油棕猝倒病菌.
7样品保存与结果记录
7.1样品保存
经检验确定携带油棕猝倒病菌的样品经登记和标记后视样品的状态采用相应的保存方式，妥善保存6个月，以备复核.保存期满后，应经灭菌处理.
7.2菌株保存与处理
高压灭菌处理. 从检测样品中分离并鉴定为油棕猝倒病菌的菌株，应妥善保存.对不需要长期保存的菌株应及时
7.3结果记录与资料保存
需要保存的记录包括：样品的种类、自然状态、来源、被为害状及为害程度（无症状也要说明），诊断时使用的方法，PCR检测应有电泳结果照片，鉴定实验室的名称，负责人和鉴定人的签字等.
