中华人民共和国国家标准
GB/T32016-2015
Silk-Determinationofaminoacids
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中国纺织工业联合会提出.
本标准由全国丝绸标准化技术委员会（SAC/TC401）归口.
本标准主要起草单位：浙江丝網科技有限公司、广州纤维产品检测研究院、鑫缘茧丝绸集团股份有限公司、苏州大学、江门出人境检验检疫局、杭州市质量技术监督检测院、广东出人境检验检疫局、浙江省检验检疫科学技术研究院.
本标准主要起草人：伍冬平、李天宝、吴淑焕、徐吴辅、孙道权、左保齐、湛权、刘雨、肖海龙、顾虎、李淳、周颖、吴刚.
蚕丝氨基酸的测定
1范围
本标准规定了蚕丝中氨基酸成分及含量的分析测定方法.
本标准适用于蚕丝中十八种氨基酸组分的测定.天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、氨酸（Va1）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、陷氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）采用酸水解法测定，胱氨酸法测定.其最低检出限均为10pmol. （Cys）和蛋氨酸（Me1）若采用酸水解法不能准确测定、应采用氧化水解法测定，色氨酸（Trp）采用碱水解
2规范性引用文件
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GB/T6529纺织品调湿和试验用标准大气GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8170数值修约规则与极限数值的表示和判定
3方法原理
法进行分离和测定.氧化水解法：蚕丝蛋白中含硫氨基酸（胱氨酸、蛋氨酸），用过甲酸氧化并经盐酸水 酸、碱水解法：蚕丝蛋白在高温酸性或碱性溶液中会发生水解，水解成的氨基酸可用离子交换色谱解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸矶，此两种产物可用离子交换色谱法分离和测定.
4试剂与材料
4.1要求
浓盐酸（12mol/L）为优级纯，其他试剂如无特别注明，均为分析纯.
4.2水
符合GB/T6682二级水要求.
4.3氮气
纯度为99.99%.
4.4酸水解法
4.4.1酸解剂：用水将浓盐酸稀释至6mol/L， 4.4.2冷冻剂：液氮、干冰乙醇或干冰丙酮.4.4.3稀释上机用缓冲液：用水将浓盐酸稀释至0.02mol/L.
4.4.4不同pH和离子强度的洗脱用缓冲液与再生液（可按仪器说明书配制），配制方法如下：
a）pH=2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠（NaCHO2H:O）和16.5mL浓盐酸b）pH=3.3的柠橡酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用 加水稀释到1000mL，用浓盐酸或500g/1.的氢氧化钠溶液调节pH至2.2：浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节pH至3.3；c）pH=4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或500g/L.的氢氧化钠溶液调节pH至4.0；d）pH=6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠（优级纯）加水稀释到 1000ml.用浓盐酸或500g/1.的氯氧化钠溶液调节pH至6.4；e）RG再生液：称取8g氢氧化钠（优级纯）和100mL乙醇（色谱纯）加水稀释至1000mL.
4.4.5三酮溶液（可按仪器说明书配制），配制方法如下：
a）pH=5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂（LiOHHO)168g加人冰乙酸（优级纯）279mL.加 水稀释到1000mL，用浓盐酸或500g/L的氢氧化钠溶液调节pH至5.2；b）三酮溶液：取150mL二甲基亚矾（CH OS）和乙酸锂溶液50mL加人4g水和三酮(CHOHO）和0.12g还原三酮（CHO2HO).
4.4.6混合氨基酸标准储备液：含甘氨酸、丙氨酸、氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸等17种常规蛋白水解液 分析用色谱纯氨基酸，各组分浓度为2.50μmol/mL（或2.00pmol/mL）.
4.4.7混合氨基酸标准工作液：吸取一定量的混合氨基酸标准储备液（4.4.6）置于50mL容量瓶中，以稀释上机用缓冲液（4.4.3）定容，混匀，使各氨基酸组分浓度为100nmol/ml.
4.5氧化水解法
4.5.1过甲酸溶液：将30%过氧化氢与88%甲酸按19的体积比混合，于室温下放置1h，置冰水浴中冷却30min，临用前配制.4.5.2氧化终止剂：48%氢溴酸.4.5.4稀释上机用柠檬酸钠缓冲液：pH=2.2，钠离子浓度为0.2mol/L.称取柠檬酸钠19.6g，用水溶 4.5.3酸解剂：同4.4.1.解后加人浓盐酸16.5mL，硫二甘醇5.0mL，苯酚1g，最后加水定容至1000mL，用G4垂熔玻璃砂芯漏斗过滤.4.5.5不同pH和离子强度的洗脱用缓冲液与再生液：配制方法同4.4.4.4.5.7磺基丙氨酸-蛋氨酸纲标准储备液：准确称取色谱纯磺基丙氨酸105.7mg和蛋氨酸113.3mg， 4.5.6三酮溶液：配制方法同4.4.5.加水溶解并定容至250mL，磺基丙氨酸与蛋氨酸碾浓度均为2.50pmol/ml.4.5.8磺基丙氨酸-蛋氨酸标准工作液：吸取磺基丙氨酸-蛋氨酸砜标准储备液（4.5.7）1.00mL，置于50mL容量瓶中，加稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.5.4）定容、混匀，使各组分浓度为50nmol/mL.
4.6碱水解法
4.6.1碱解剂：4mol/L的氢氧化锂或氢氧化钠溶液.可用水溶解167.8g氢氧化锂（LiOHHO）并稀释至1000mL的方法制取，使用前取适量超声或通氮脱气.4.6.36mol/L的盐酸溶液：配制方法同4.4.1. 4.6.2冷冻剂：同4.4.24.6.4稀释上机用柠橡酸钠缓冲液：pH=4.3.钠离子浓度为0.2mol/L.称取柠檬酸钠14.71g、氯化铵2.92g和柠檬酸10.50g，溶于500mL水，加人硫二甘醇5mL和辛酸0.1mL，最后定容
至1 000 mL 4.6.5不同pH和离子强度的洗脱用缓冲液与再生液：配制方法同4.4.4.4.6.7色氨酸标准储备液：准确称取色谱纯色氨酸102.0mg.加少许水和数滴0.1mol/1.氢氧化钠，使 4.6.6市三酮溶液：配制方法同4.4.5.之溶解，定量地转移至100mL容量瓶中，加水定容.色氨酸浓度为5.00pmol/ml.4.6.8色氨酸标准工作液：准确吸取2.00mL色氨酸标准储备液（4.6.7）置于50mL容量瓶中，并用稀释上机用柠檬酸钠缓冲液（4.6.4）进行定容，使色氨酸浓度为200nmol/ml.
注：4.4.7、4 5.8 4.6.8中标准工作液体宜现配现用.也可置于4C条件下储存，有效期为3个月.
5仪器与设备
5.1分析天平：分度值≤0.1mg.5.2水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20mL~30mL.用去离子水冲洗干净并烘干.5.3聚四氯乙烯衬管.5.4真空泵.5.5喷灯或熔焊机.5.7真空干燥器：温度可调节. 5.6恒温干燥箱或水解炉.5.8氨基酸自动分析仅：三酮柱后衍生离子交换色谱仅，要求各氨基酸的分辨率大于90%.
6样品及前处理
6.1取样
依据GB/T6529在标准大气条件下将样品调湿平衡，剪碎、混匀，用分析天平称取具代表性的样品1 g士0.1g备用.
6.2样品前处理
6.2.1酸水解法
6.2.1.1称取20mg的试样（6.1）置水解管中，加10mL酸解剂（4.4.1），置冷冻剂（4.4.2）中冷冻3min~5min.然后，抽真空（近0Pa），充入氮气，再抽真空充氮气，重复三次，在充氮气状态下封口.6.2.1.2将封口后的水解管放在（110土1）℃恒温干燥箱中，水解22h 6.2.1.3取出水解管，冷却至室温，混匀、开管、过滤，用水多次冲洗水解管，并与水解液全部转移至100mL容量瓶中用水定容.吸取1mL~2mL水解定容液，用真空干燥器在60C蒸发至干，加少许水溶解残留物，重复蒸干2~3次.准确加人1mL~2mL的稀释上机用缓冲液（4.4.3），摇匀，充分溶解后离心或用0.22pm水系微孔滤头过滤后，取上清液上机测定.
6.2.2氧化水解法
6.2.2.1氧化：称取50mg的试样（6.1）.置于水解管中，于冰水浴中冷却30min后加入已经冷却的过甲酸溶液（4.5.1）2mL，待样品全部润湿，盖好试管盖（不能摇动），连同冰水浴一起置于0℃冰箱中，反应16 h.
6.2.2.2水解：向样品氧化液（6.2.2.1）中加人氢澳酸（4.5.2）0.3mL，振摇，放回冰水浴静置30min用真空干燥器在60C下蒸发至干.加入酸解剂（4.5.3)15mL，抽真空（近0Pa），充人氮气，再抽真空充氮
