中华人民共和国国家标准
GB/T32946-2016
Determination of proline in honey-High performance liquid chromatography
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由中华全国供销合作总社提出. 本标准由全国蜂产品标准化工作组归口.本标准起草单位：中国农业科学院蜜蜂研究所、农业部蜂产品质量监督检验测试中心（北京）、中国养蜂学会.
本标准主要起草人：李烟、张金振、黄京平、吴杰、吴黎明、赵静、薛晓锋、周金慧、陈芳、王鹏、陈兰珍.
蜂蜜中脯氨酸的测定高效液相色谱法
1范围
本标准规定了蜂蜜中脯氨酸含量的高效液相色谱测定方法.本标准适用于蜂蜜中脯氨酸含量的测定.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3方法提要
试样中的脯氨酸用硼酸缓冲液提取后，经柱前衍生，液相色谱荧光检测器检测，外标法定量.
4试剂和材料
4.1除非另有说明，均使用分析试剂，水为GB/T6682规定的一级水.4.2甲醇：色谱纯.4.3乙晴：色谱纯.4.4四氢呋喃：色谱纯. 4.5乙酸钠.4.6乙酸.4.7硼酸.4.9氢氧化钠. 4.8乙二胺四乙酸二钠.4.10磷酸，4.11盐酸.4.12L-脯氨酸标准品（CAS号：147-85-3）：纯度≥99%4.14氢氧化钠溶液（0.1mol/1）：称取2.00g氢氧化钠，溶于500mL水中，混匀，转移至聚乙烯瓶中， 密闭放置，4.15乙酸钠缓冲液（0.1mol/L)：称取13.60g乙酸钠，溶解于1L水中，用乙酸调节pH至7.2.抽滤脱气.4.16硼酸缓冲液（0.1mol/1）：称取乙二胺四乙酸二钠0.186g、硼酸3.09g，溶解于500mL水中，氢4.17盐酸溶液（0.1mol/L)；取8.33ml盐酸，定容至1L. 氧化钠溶液调pH至8.04.18NBD-F溶液（100mmoL/L)：称取NBD-F0.0183g于棕色液相进样瓶中，加人1mL乙溶解，
GB/T 32946-2016
密封保存.4.19脯氨酸标准储备液（100mg/L）：准确称取适量脯氨酸标准品，用硼酸缓冲液溶解后，贮存在4C冰箱中.
4.200.22gum水系滤膜.
5仪器和设备
5.2分析天平：感量0.01g0.001g.0.00001g 5.1高效液相色谱仪：配荧光检测器.5.3涡旋混勾器.5.4pH计：测量精度土0.02.5.5恒温水浴锅.5.6超声波清洗器.
6试样的制备与保存
将样品搅拌均匀，分出0.5kg试样置于样品瓶中，密封标记，于4℃下保存.
7分析步骤
7.1提取
称取试样1g，精确至0.001g.置于100mL烧杯中，加人20.0mL硼酸缓冲液，用玻璃棒轻轻搅拌溶解，超声提取10min.将溶液转移至50mL容量瓶中，用硼酸缓冲液定容至刻度，混匀，0.22pm滤 膜过滤，滤液待衍生化.
7.2衍生化
取200μL样品溶液于棕色液相色谱进样瓶中，再分别加人70L乙晴、30pLNBD-F溶液，密封，反应，混匀，待测，
7.3液相色谱参考条件
液相色谱条件参考以下参数：
a）色谱柱：Cx5pm，150mm×4.6mm（内径），或相当者；b）流动相：A：0.1mol/L乙酸钠缓冲液-甲醇-四氢映哺（900955)；B;甲醇；c）柱温：30℃；d）进样量：20pL:e）荧光检测波长：激发波长470nm，发射波长530nm； ）梯度洗脱程序见表1.
表1梯度洗脱程序（VV）
时间/min A/% B/% 流速/(ml/min)0 00 100 0 1 00 50 .00 75 25 1 08 00 75 0 100 25 1 0 1 010 00 0 100 1 012 00 100 0 1 015 00 100 0 1 0
7.4液相色谱测定
用硼酸缓冲液稀释标准储备液，依次配成20.00mg/L、10.00mg/1、5.00mg/L、2.50mg/L、1.25mg/L、0.625mg/L的脯氨酸标准工作溶液，按7.2步骤进行衍生.在上述色谱条件下，测定6个浓度水平标准工作溶液的峰面积，以峰面积对相应质量浓度绘制标准工作曲线，然后测定未知样品，用 标准工作曲线对未知样品进行定量.样品溶液中脯氨酸的响应值应在仪器的线性范围内.脯氨酸的参考保留时间为5.6min.脯氨酸标准溶液色谱图和蜂蜜样品色谱图参见附录A中图A.1和图A.2.
7.5平行试验
按上述步骤，对同一试样进行两次平行测定.
8结果计算
结果用色谱数据处理软件或按式（1）计算：
式中：
X 试样中脯氨酸的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；V定容体积，单位为毫升（mL）； -从标准工作曲线上得到的被测组分溶液的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）；m-样液所代表试样的质量，单位为克（g）.测定结果取其两次测定的算术平均值，计算结果保留小数点后一位.
9定量下限
本方法的定量下限为10.0mg/kg.
