中华人民共和国国家标准
GB/T33309-2016
化妆品中维生素B（吡哆素、盐酸吡哆素、 吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯） 的测定高效液相色谱法
pyridoxine fatty acid esters and pyridoxal 5-phosphate ） in cosmetics Determination ofvitamin B(pyridoxinepyridoxine hydrochloride.High performance liquid chromatography
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由中国轻工业联合会提出.
本标准由全国香料香精化妆品标准化技术委员会（SAC/TC257）归口.
本标准起草单位：山东省产品质量监督检验研究院、聊城大学、山东省食品药品检验研究院、上海市日用化学工业研究所.
刘艳明、崔玉花、刘桂亮、张艳侠、沈敏. 本标准主要起草人：霍艳敏、王骏、张娟、张卉、周莉莉、段文增、邹惠玲、王艳丽、薛霞、宿书芳、
化妆品中维生素B（吡哆素、盐酸吡哆素、 吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯） 的测定高效液相色谱法
1范围
效液相色谱测定方法. 本标准规定了化妆品中维生素B（毗哆素、盐酸吡哆素、毗哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯）的高
本标准适用于膏霜、乳液、液体类等化妆品中毗哆素、盐酸耽哆素、吡哆素脂肪酸酯及吡哆醛5-磷酸酯的测定
本标准方法检出限为：吡哆醛1.0mg/kg、吡哆素0.3mg/kg，定量限为：哦哆醛2.5mg/kg、吡哆素1.2 mg/kg-
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3原理
本标准通过酶解、皂化反应将样品中的维生素B均转化为毗哆素或毗哆醛的形式，利用高效液相色谱配荧光检测器进行分离及分析，保留时间定性，外标法定量测定维生素B的含量.
4试剂和材料
除非另有说明，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水.
4.1甲醇：色谱纯.4.2七氟丁酸：色谱纯.4.3碱性磷酸酶：酶活力不小于10U/mg.4.4磷酸：优级纯.4.5氨水：优级纯，含量为25%~28%. 4.6磷酸二氢铵：优级纯.4.7磷酸氢二钠（NaHPO2HO）.4.8乙醇.4.10氢氧化钾水溶液：称取固体氢氧化钾250g.加人200mL.水溶解. 4.9盐酸.4.1130%磷酸水溶液（体积分数）：准确量取30m1磷酸（4.4）和70mL水，混匀后备用.4.1230%氨水溶液（体积分数）：准确量取30mL氨水（4.5）和70mL水，混匀后备用.
4.13盐酸溶液（5.0mol/L 0.1mol/L)：量取40mL、0.8mL盐酸（4.9）分别放入两个100mL容量瓶中，用水定容，分别得5.0mol/L、0.1mol/L盐酸溶液.4.14氢氧化钠溶液（5.0mol/L，0.1mol/L）：称取20g、0.4g氢氧化钠用水溶解，分别放入两个100mL容 量瓶中，用水定容，分别得5.0mol/L0.1mol/L氢氧化钠溶液.4.15离子对试剂缓冲溶液[0.02mol/1磷酸二氢铵缓冲溶液（含0.001mol/L七氟丁酸）]：称取2.30g磷酸二氢铵，加人约980m1水溶解用30%磷酸（4.11)或30%氨水（4.12）调节pH值至4.5加入170L七氟丁酸（4.2）用水定容至11备用.4.16磷酸氢二钠溶液（0.1mol/L)：称取17.8g磷酸氢二钠（4.7），用水溶解，定容至1000mL，用氢氧 化钠溶液（4.14）调节pH值至9.8，备用.4.17碱性磷酸酶溶液（1.0g/L）：称取50mg碱性磷酸酶，用水定容至50ml.临用前配制.4.18标准样品：吡哆素和晚哆醛，纯度不小于99.0%.维生素B（此哆素、盐酸毗哆素、吡哆素脂肪酸酯和毗哆醛5-磷酸酯）的CAS号、分子式、相对分子质量、化学结构式参见附录A.4.19维生素B（吡哆素、毗哆醛）标准贮备液（1mg/mL）：准确称取0.025g（精确至0.0001g）毗哆 素、毗哆醛标准品，分别置于25mL容量瓶中，用水溶解定容，配制成浓度为1mg/mL的标准储备液，于4℃避光保存，有效期3个月.4.20维生素B（吡哆素、毗哆醛）混合标准中间液1（100μg/mL）、混合标准中间液2（10μg/mL）：分4.21维生素B（此哆素、毗哆醛）混合标准系列工作液：分别准确吸取维生素B混合标准中间液2（4.20） 别准确吸取维生素B标准贮备液（4.19)5ml、0.5mL至50ml容量瓶中.用水溶解、定容，混匀.0.1mL、1.0mL混合标准中间液1（4.20）1.0mL、5.0mL、10.0mL20.0mL至100mL容量瓶中，用水溶解定容.该标准系列浓度分别为0.01μg/mL、0.1μg/mL、1.0μg/mL、5.0μg/ml、10.0μg/ml、20.0μg/mL临用前配制.
4.22微孔滤膜：0.45μm，有机相.
5仅器和设备
5.1高效液相色谱（HPLC)仅：配有荧光检测器.5.2分析天平：感量为0.0001g和0.01g. 5.3涡旋混合器.5.4水浴振荡器.5.5pH计.5.6具塞塑料离心管：50mL.
6分析步骤
6.1试样处理
6.1.1试样标签中标注含吡哆醛5-磷酸酯的试样
称取1.0g混合均匀试样（精确至0.0001g）置于50mL具塞塑料离心管（5.6）中，加人1.0mL碱性磷酸酶溶液（4.17）、用磷酸氢二钠溶液（4.16）定容至10.0mL，用涡旋混合器（5.3）充分混匀，置于水浴振荡器（5.4）上，于（37±1)C振荡酶解12h以上.
6.1.2试样标签中标注含吡哆素、盐酸吡哆素及吡哆素脂肪酸酯的试样
称取1.0g混合均匀试样（精确至0.0001g）置于50mL具塞塑料离心管（5.6）中，加入10.0mL
水，用涡旋混合器（5.3）充分混匀.
6.2待测液的制备
于上述处理的试样溶液（6.1.1或6.1.2）中加人20.0mL乙醇，充分混匀后加人1.0mL氢氧化钾溶液（4.10）混匀，置于水浴振荡器（5.4）上于45℃士2℃避光振荡皂化45min.皂化完成后，取出冷却至室温，加人1.05mL盐酸（4.9），用盐酸溶液（4.13）或氢氧化钠溶液（4.14）调节试样pH值至7.0，将试样转移至50.0mL容量瓶中，用水定容至50.0mL（V），混匀，静置.准确移取5.0mL（V：）上层清液于25.0mL容量瓶中，用水定容至25.0mL（V），混匀，上清液过微孔滤膜（4.22）后，供HPLC测定.
6.3测定
6.3.1参考条件
高效液相色谱参考条件如下：
a）色谱柱：C柱，250mm×4.6mm（i.d.）.5pm，或相当者.b）流动相：溶剂A：甲醇，溶剂B：离子对试剂缓冲溶液（4.15）.c）流速：1.0 mL/min. d）检测波长：激发波长293nm，发射波长395nm.e）柱温：35℃f）进样量：10pl.g）梯度洗脱条件见表1.
表1液相色谱梯度洗脱条件
时间/min A/ % B/%0 10 9012 0 10 9015 0 25 7525 0 25 7526.0 10 9035.0 10 90
6.3.2标准工作曲线绘制
系列标准工作液（4.21）按色谱条件（6.3.1）进行测定，以色谱峰的峰面积为纵坐标，对应的溶液浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线.毗哆醛、毗哆素标准样品色谱图参见附录B.
6.3.3试样测定
试样溶液（6.2）按色谱条件（6.3.1）进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积，由色谱峰的峰面积从标准曲线上求出相应的吡哆醛、毗哆素的浓度.样品溶液中被测物的响应值均应在仪器测定的线性范围内，超过线性范围的应稀释后再进样分析.
6.4空白试验
除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行.
