中华人民共和国国家标准
GB/T 37512-2019
粮油检验实际与理论ECN42 甘三酯含量差值的测定
Inspection of grain and oils-Determination of the difference between actual andtheoretical content of triacylglycerols with ECN 42
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.本标准由国家粮食和物资储备局提出.本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAC/TC270）归口.本标准起草单位：国家粮食局科学研究院. 本标准主要起草人：张蕊、薛雅琳、张冰.
粮油检验实际与理论ECN42 甘三酯含量差值的测定
1范围
本标准规定了油脂中实际等效碳数42（ECN42upic）甘三酯含量与理论等效碳数42（ECN42me）甘三酯含量绝对差值的测定方法.
本标准适用于微榄油，适用于检测各类别微油中是否掺有少量籽油（富含亚油酸）.
注：ECN42mc由高效液相色谱法测得，ECN42ae由气相色谱法测定的脂肪酸组成后计算所得.
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB5009.168食品安全国家标准食品中脂肪酸的测定
GB/T23347橄榄油、油橄果渣油
COI/T.20/Doc.No.24橄榄油和撤榄果渣油脂肪酸甲酯制备（Preparation of the fatty acidmethyl esters from olive oil and olive-pomace oil)
3原理
ECN42m甘三酯含量以及其与ECN42upc甘三酯含量差值是通过其他方法获得的数据协同计算得到，包括气相色谱法测定脂肪酸组成、计算理论ECN42甘三酯含量和高效液相色谱法测定ECN42甘三酯含量.
对于真实橄榄油由高效液相色谱法测得的实际ECN42甘三酯含量与由气相色谱法测得的脂肪则表明橄榄油中含有籽油.
4仪器设备
4.1圆底烧瓶；250mL和500mL.4.2烧杯：100ml.4.3玻璃色谱柱：内径21mm，长450mm，配有旋塞，上端口为标准内磨口.4.5玻璃棒：长600mm. 4.4分液漏斗：250mL，底部为标准外磨口，与玻璃色谱柱上端口配套.4.6玻璃漏斗：直径80mm.4.7容量瓶：50mL.4.8容量瓶：20mL，4.10高效液相色谱：配有柱温湿控装置. 4.9旋转蒸发器.
4.11注射器：10pl.4.12检测器：示差折光检测器.最高灵敏度折光指数至少是10.4.13不锈钢色谱柱：柱长250mm，柱内径4.5mm，填料粒径5pm，含碳22%~23%十八烷基键合硅胶.柱效宜确保三油酸甘油酯与邻近保留时间的甘三酯色谱峰分离良好.4.14样品瓶：2 mL，带孔旋盖（Teflon垫）.
5试剂
除另有说明外，所用试剂均为分析纯.
5.2乙醚：无过氧化物，新蒸馏.
5.6丙酮：色谱级.
5.7乙晴或丙睛：色谱级，
5.8流动相：乙晴丙酮（可调节两者比例获得满意分离效果；初始50：50）或丙睛，应脱气，并可能需多次脱气直至不影响分离.
5.9溶剂：丙酮.
5.10甘三酯参考物质：商品化甘三酯（三棕榈酸甘油酯、三油酸甘三酯等），根据等效碳数确定保留时间：或参考附录A中低亚油酸橄榄油（橄榄油）、高亚油酸橄榄油（混有籽油的橄榄油）的液相色谱图（参见图A.1、图A.2).
注1：洗脱顺序可由计算的等效碳数确定，等效碳数（ECN）定义为ECN=CN-2n，其中CN为碳数为双键数；若 考虑双键来源，计算等效碳数更加精确.如n"分别是油酸、亚油酸和亚麻酸双键个数，等效碳数可依据下式计算：
其中系数d、d，和d可由甘三酯参考物质计算得到.在本标准规定条件下，关系式近似于： ECN=CNd -d d
注2：计算儿种甘三酯参考物质相对于三油酸甘油酯的选择因子：
其中调整保留时间RT'=RT-RTsx
5.11固相萃取柱（SPE）:硅胶1g，6mL.
6操作步骤
6.1试样制备
为避免干扰物质引起假阳性结果，样品应进行纯化.
6.1.2传统柱色谱纯化
6.1.2.1色谱柱的制备
向色谱柱（4.3）中加人30mL洗脱液（5.3），然后加人少许玻璃棉（5.5），用玻璃棒（4.5）将玻璃棉压
入色谱柱底端.
称取25g硅胶（5.4）于100mL烧杯中，加人80mL洗脱液（5.3）制成悬浮液.通过玻璃漏斗（4.6）将悬浮液转移至色谱柱中.
用洗脱液（5.3）冲洗烧杯，将冲洗液转移至色谱柱中，以确保将硅胶完全转移至色谱柱中.打开旋塞，放掉洗脱液至硅胶上面1cm处.
6.1.2.2柱色谱
准确称取2.5g士0.1g油样于50mL容量瓶（4.7）中，精确至0.001g.如必要，油样可事先过滤、均质和脱水.加人约20mL洗脱液（5.3）溶解油样.如必要，稍微加热以使其更容易溶解.冷却至室温，用洗脱液稀释至刻度.
通过移液管转移20mL上述溶液于6.1.2.1制备的色谱柱中，打开旋塞，让溶剂洗脱至硅胶层.
用150mL洗脱液（5.3）进行色谱柱洗脱，流速约2mL/min（150mL洗脱液通过色谱柱大约需60 min~70 min).
流出液收集到250mL已事先恒重并准确称重（精确至0.001g）的圆底烧瓶（4.1）里.用旋转蒸发器（4.9）除去溶剂.称重后的残留物用于制备高效液相色谱分析用溶液和制备甲酯.
特级初榨橄榄油、中级初榨橄油、精炼橄榄油和混合橄榄油的样品回收率应至少90%，初榨油橄横灯油和撤榄果渣油的样品回收率应至少80%.
6.1.3固相萃取（SPE）纯化
真空条件下，用6mL正已烷（5.1）活化SPE硅胶柱，整个过程不得使小柱干润. 称取0.12g样品于2mL样品瓶（4.14），准确至0.001g，加人0.5mL正己烷（5.1）溶解.SPE柱上样，真空条件下用10mL正已烷1乙醚（87：13，体积比）洗脱.流出液用旋转蒸发器（4.9）除去溶剂.残留物溶于2mL丙酮（5.6），用于高效液相色谱分析.
6.2高效液相色谱分析
6.2.1色谱分析试样制备
相色语分析. 称取0.5g±0.001g样品于10mL容量瓶，用溶剂（5.9）稀释至10mL，制备成5%样品溶液，待液
6.2.2上样
设置色谱参数.以1.5mL/min速度泵人流动相（5.8）冲洗整个系统，直至基线稳定.进样10pl（6.2.1或6.1中制备的样品）洗脱至ECN52色谱峰.
6.2.3结果计算
使用峰面积归一化法，即，假定ECN42到ECN52的甘三酯峰面积总和为100%.按式（1）计算每种甘三酯的相对百分含量X，以%计：
式中：
A每种甘三酯的峰面积；
∑AECN42到ECN52甘三酯峰面积的和.
计算结果保留至小数点后两位.
