中华人民共和国烟草行业标准
YC/T627-2025
烟草品种鉴定技术规程 SSR分子标记法
Technical code ofpracticefor tobaccovarietiesidentification-SSRmarkermethod
国家烟草专卖局 发布
前言
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别专利的资任.
本文件由国家烟草专卖局提出.
本文件由全国烟草标准化技术委员会农业分技术委员会（SAC/TC144/SC2）归口.
本文件起草单位：中国农业科学院烟草研究所、国家烟草基因研究中心、云南省烟草农业科学研究院、贵州省烟草科学研究院、湖北省烟草科学研究院、湖南省烟草科学研究所.
本文件主要起草人：任民、刘国祥、杨爱国、孙洋洋、张剑锋、李、蔡长春、余世洲、程立锐、肖炳光、郭玉双、曹培健、胡日生.
烟草品种鉴定技术规程SSR分子标记法
1范围
本文件规定了利用简单重复序列（SimpleSequenceRepeats，SSR）标记进行烟草（Nicoliana taba-cumL.）品种鉴定的操作程序、结果统计和结果判定.
本文件适用于烟草品种SSR指纹数据采集和品种鉴定.
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款.其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件.
GB/T3543.2农作物种子检验规程第2部分：扦样GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T2594植物品种鉴定DNA分子标记法总则YC/T369植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南烤烟
3术语和定义
NY/T2594界定的术语和定义适用于本文件.
4原理
不同烟草品种基因组中等位SSR的长度存在差异，这种差异可通过PCR扩增及电泳方法进行检测，进而区分不同的烟草品种.
5主要仪器设备及试剂
主要仅器设备及试剂按附录A.
6溶液配制
溶液配制按附录B.
7引物相关信息
引物名单及序列见附录C，引物相关信息见附录D.
8参照品种
参照品种相关信息见附录E.
9操作程序
9.1样品准备
现定.每份样品取不少于15个个体的叶片或其他等效物，混合分析，必要时进行单个个体检测. 送验样品可为种子、幼苗、叶片等个体、组织或器官，需要扦样时样品数量应符合GB/T3543.2的
9.2DNA提取
采用CTAB法提取DNA，具体操作步骤如下
a）取种子、幼苗、叶片等组细或器官200mg~300mg，业于2.0ml.离心管，加液氮充分研磨； b）每管加人600ul6C预热的CTAB提取液充分温合，65C情温水浴45min~60min，每间隔10min颜倒混均一次：c) 每管加人 体积的 三氧甲烷-异戊醇（24：1.体积比）.轻缓混分 ，静置10min：d) 例离心管数款，在一20C放置30min；4℃，12000r/min离心10min，年上清液； 4C12 000t/m mn离心15min后，吸取上清液至新的离心管，再加A等体积预冷的异丙醇，颜e) 用 0% 体积数）乙醇洗涤DNA沉淀2次，风平，加人100山水（A1）TE缓冲液，检DN 浓度和质量，20C保存
注：以 为排存的DNA提取方达所状DNA费量能够满是PeR扩措要求的其他DSA提最方法适用.DNA溶流在260mm和280mm的续外光度OD 的介于1
PCR扩增反应体系的息体积和各组分的终依度参照表上配服，耳依据试验条件调整
表1PCR增反应体系
灰应组 原浓度 终浓度 荐体积/pl10×缓冲 （含MCL） 10X 1X 2.0IINP 10 mmol/L 0.2 0.4TaqDNA聚合解 5 U/μL. 0.05U/ 0.2上游引物 下游引物 10 μmol/L pmol/L 0.5DNA 10μmol/l 0.25 μmol/L 0.5水（A.2.1) 25 ng/ 2.5 ng/μL 2.0总体积 14.4TagDNA聚合商为普通酶，可采用PCR试测盒代答TayDNA聚合确、dNTP、Mg 20.0
9.3.2反应程序
95C预变性5min；95C变性40s 54C退火45s 72C延伸40s，共35个循环：72C延伸10min，
产物4C保存.
9.4PCR产物检测
9.4.1变性聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳（PAGE）
9.4.1.1制胶
洗涤剂用清水将玻璃板清洗干净.再用水（A.2.2）、75%（体积分数）乙醇分别擦洗2遍.玻璃板干燥后，将1mL亲和硅烷工作液均匀涂在长玻璃板上，将1mL疏水硅烷工作液均匀涂在带凹槽的短玻璃板上，玻璃板干燥后，将0.4mm厚的塑料隔条整齐放在长玻璃板两侧，盖上凹槽短玻璃板，用夹子 周定，用水平仪检查是否水平.取80mL.6%PAGE胶溶液，加人60gLTEMED和180uL10%的过硫酸铵（过硫酸铵的用量与室温成反比，需根据室温调整用量），轻轻摇匀（勿产生大量气泡），将胶灌满玻璃胶室，在凹槽处将鲨鱼齿梳的平齐端向里轻轻人胶液5mm~6mm.胶液聚合1.5h后，清理胶板表面溢出的胶液，轻轻拔出梳子，用水清洗干净备用.
注：能够满足SSR分析检测要求的预制成品胶板也能用于后续电泳.
9.4.1.2预电泳
将聚合好的胶板安装于电泳槽上，在电泳正极槽（下槽）加人600mL的1XTBE缓冲液，负极槽（上槽）加入600mL的1×TBE缓冲液，在1800V恒压预电泳10min~20min.
9.4.1.3变性
在20μLPCR产物中加人4pL.6X加样缓冲液，混匀.在PCR仪上95C变性5min，取出迅速置于冰上，冷却10min以上.
9.4.1.4电泳
用移液器清除凝胶顶端气泡和杂质.将样品梳插人胶1mm~2mm.每一个加样孔点入3L~5pL样品，在胶板一侧点人DNAMarker.1800V恒压电泳，电泳时间参考二甲苯青指示带移动的位置和扩增产物预期片段大小范围（见附录D）.二甲苯青指示带在6%PAGE胶电泳的移动位置与230bp扩增产物冰动的位置大致相当.扩增产物片段大小在（100±30）bp、（150±30）bp、（200±30）bp、 （250土30）bp范围的电泳参考时间分别为1.5h、2.0h、2.5h、3.5h.电泳结束后关闭电源，取下玻璃板并轻轻撬开，凝胶附着在长玻璃板上.
9.4.1.5银染
胶板，置于摇床上染色5min~10min.将胶板移人水（A.2.2）中漂洗30s~60s.再移人显影液中，轻摇显影槽，使显影液均匀覆盖胶板，待带型清晰，将胶板移人水（A.2.2）中漂洗5min，晾干胶板，放在胶片观察灯上观察记录结果，用数码相机或凝胶成像系统拍照保存.
9.4.2毛细管电泳
9.4.2.1样品准备
别加人2pL的PCR扩增产物和22uL的DNA分析仪用电泳缓冲液. 在DNA分析仪专用96孔上样板中选取一孔加人24L的DNA分析仪用分子量内标，其余孔分
