中华人民共和国国家标准
GB/T36831-2018
Detection andidentification of Cronartiumfusiforme Hedgcock&Hunt ex Cummins
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局. 本标准起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民
本标准主要起草人：王颖、程颖慧、叶奕优、余道坚、高瑞芳、章桂明、李芳荣、史亚千、李秋枫、刘新娇、封立平、陈吴健.
松纺锤瘤锈病菌检疫鉴定方法
1范围
定方法. 本标准规定了松纺锤瘤锈病菌（Cronarzium fusiforme Hedgcock&.Hunt ex Cummins）的检疫鉴本标准适用于松纺锤瘤锈病菌寄主、转主寄主及其产品中携带松纺锤瘤锈病菌的检疫鉴定.
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
2.1性孢子器pycnia由担孢子萌发形成的单核菌丝体在侵染寄主时形成的锈菌性器官.
2.2性孢子pycniospore性孢子器中产生的单核孢子.
2.3 锈孢子器aecia由性孢子与受精丝结合或与单核菌丝结合产生的双核次生菌丝组织.
2.5夏孢子堆uredinium由双核菌丝产生的成堆的黄色或橙黄色的双核孢子.
2.7冬孢子teliospore由双核菌丝产生的厚壁有性孢子在生长后期形成的单胞或多胞的休眠孢子.
2.8冬孢子堆telia冬孢子聚集在一起形成的组织.
2.9 担子basidia寄主体上的冬孢子萌发形成的组织.
2.10担孢子basidiospore 担子横裂四胞，每胞生一小柄，其上着生单胞、无色或稍带黄色的孢子.
3基本信息
英文名：Southern fusiform rust
学名：Cronartium fusiforme Hedgcock &. Hunt ex Cummins
无性态：Peridermiam fusiforme J.C.Arthur &.Kern.
分类地位：真菌界Fungi，担子菌门 Basidiomycota，柄锈菌亚门 Puccniomycotina，柄锈菌纲 Puccin-iomycetes，柄锈菌目 Pucciniales，柱锈菌科 Cronartiaceae，柱锈属Cronarium.
传播途径：松纺锤瘤锈病菌主要通过气流及感病寄主传播.
近似种：油松疱锈病菌Cronarriam coleosporioides，北美松疱锈病菌C.andrae，香蕨柱锈菌C.ptoniae，苏格兰松疱锈病菌C.flaccidum.
松纺锤瘤锈病菌的其他信息参见附录A~附录C.
4方法原理
松疱锈病菌的形态学特征及ITS1/ITS4核酸序列比对结果作为检疫鉴定该病菌的主要依据，同时参考病原菌的发生国家和地区、寄主范围及为害症状.
5仪器用具和主要试剂
5.1仪器用具
高压灭菌锅、显微镜、体视显微镜、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像仪、高速冷冻离心机、恒温水浴锅、样品袋、标签、放大镜、培养皿、载玻片、盖玻片、手术刀、手术剪、镊子、吸管、酒精灯、滤纸等.
5.2主要试剂
三羟甲基氨基甲烷乙酸缓冲液、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙酸、乙醇、引物ITS1/ITS4、PCR缓冲液、Tag 聚合酶、dNTPs（dATPdTTPdCTP、dGTP）、DNA分子量Marker等分子生物学试剂及基因组提取试剂盒.
6检疫签定
6.1症状检查
观察松属寄主植物：
a）主干和枝条上是否有圆形、纺锤形或不规则的肿瘤，肿瘤表面皮层不规则破裂，且破裂处当年生出新皮层，来年再破裂，皮层完全脱落后，露出浸透松脂的木质部，颜色较深，犹如灼伤：b）肿瘤上部枝条或树干日久便枯死或风折，检查在肿瘤裂缝处是否有桔黄色蜜滴溢出，其中混有性孢子；d）受侵种苗是否出现丛枝. c）肿瘤表皮下是否有黄色疱状孢子器，含有大量的黄色粉状锈孢子：
观察栎属等转主寄主植物的叶片，是否出现叶斑及黄色小点，即夏孢子堆，叶的正面相应部分色泽较健康部分稍涉，在夏孢子维中生出许多褐色至暗褐色的毛状物，即冬孢子柱.
松纺锤瘤锈病菌及其近似种的症状及病原菌特征比较参见附录B.
将可疑样品带回实验室作进一步检验，记录样品品种、数量、来源国及取样地点、取样人和取样日期等信息.
6.2形态学特征
锈孢子器球形至梭形，壁薄，厚度为2个～3个细胞，有疣状突起：锈孢子倒卵形至近球形，大小为（22m~28μm）×（13μm~18pm），具有粗糙的疣状隆起，高为1.5pm~2.5μm.夏孢子堆着生在叶背面，半球形，偶尔有侧丝，透明至棕色：夏孢子卵形至椭圆形，微黄色，大小为（17pm~21μm）×（12pm~15μm），夏孢子表面有均匀锐利的小刺，长为0.7μm~1.5μm.冬孢子堆着生在叶背面，散开，呈纤维状栗棕色袍子柱；冬孢子圆柱形至梭形，微黄棕色，大小为（35gm~70um）×（14gm~27gm），壁光滑，有1个或2个萌芽孔.松纺锤瘤锈病菌及其近似种的病菌形态鉴定特征参见附录B 和附录C.
6.3核酸序列比对
6.3.1引物
采用ITS1/ITS4进行扩增，引物序列为：ITS1:5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3
6.3.2DNA提取
取病原菌孢子提取DNA（参见附录D）.
6.3.3PCR反应
PCR反应体系总体积30 μL 包含：缓冲液3.0zL;10 mmol/1 dNTP 0.5 pL;Taq 聚合酶2.5U;引l物各0.5μL（20μmol/L）：DNA模板1μL.反应程序：94C预变性2min；94℃1min，53℃1min72C延伸1.5min30个循环；72C延伸10min.
扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶1XTAE缓冲液中电泳，EB染色后凝胶成像，如有目标片段大小的单带出现扩增产物进行序列测定.
将测序获得的序列与NCBl网站GenBank中相关序列进行同源性比对分析.
7结果判定
病害症状符合6.1，而且病菌的形态学特征符合6.2，ITS序列比对结果与6.3描述相符，判定为松纺锤瘤锈病菌.
8样品保存与处理
松纺锤瘤锈病的样品或病组织及玻片标本、核酸等需保存至少6个月，以备复验、谈判和仲裁.保
