中华人民共和国国家标准
GB/T 35330-2017
Detection and identification of Hosta virusX
中国国家标准化管理委员会 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
请注意本文件的某些内容可能涉及专利.本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口.
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、国家质量监督检验检疫总局信息中心、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、中国农业大学.
本标准主要起草人：张永江、张燕平、方志鹏、辛言言、魏梅生、冯黎霞、沈建国、李桂芬、李曼、朱水芳.
玉馨属植物X病毒检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了玉普属植物X病毒（HoxtavirusX）的检疫鉴定方法.本标准适用于可能携带玉警属植物X病毒的植物及其产品的检疫鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法SN/T2964植物病毒检测规范SN/T3457植物病毒分子生物学检测规范
3玉警属植物X病毒基本信息
缩写：HVX. 异名：玉簪属植物病毒X，玉警属X病毒，玉簪X病毒，玉睿属（百合科）植物病毒.分类地位：曲线病毒科（Fleriviridae），马铃薯X病毒属（Poteziras）.玉簪属植物X病毒的其他信息参见附录A.
学名：Hoxta viras X.
4方法原理
玉管属植物X病毒的免疫原性和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据.根据HVX与抗体之间的特异性反应对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）和胶体金免疫试纸条检测；依据HVX的基因组特征建立RT-PCR、实时荧光RT-PCR和RT-LAMP检测方法；通过这些方法的 有效组合，判断样品是否带有HVX.
5仪器、用具及试剂
5.1仪器
冰机、涡旋振荡器、磁力搅拌器、高压灭菌锅、pH计、超净工作台、PCR仅、微波炉、电泳仪、电泳槽、凝胶 电子天平（感量0.001g）、高速冷冻离心机、小型瞬时离心机、普通冰箱、超低温冰箱（一80C）、制成像分析仪、酶标仪.
5.2用具
酶联板、可调移液器（2.5pL、10μL、20μL、100μL、200μL、1 000μL）和可调移液器头、离心管、研
钵、微型磨等.
5.3试剂
除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水应符合GB/T6682中相关规定.DAS-ELISA试剂附录E. 见附录B;RT-PCR检测试剂见附录C：实时荧光RT-PCR检测试剂见附录D;RT-LAMP检测试剂见
6抽样和样品制备
6.1抽样
其产品抽样方法按照SN/T2122中的规定执行. 有病毒危害症状的植物材料单独抽样，HVX的危害症状描述参见附录A：无症状的种子、苗木及
6.2样品制备
样品制备参照SN/T2964和SN/T3457规定执行.具体如下：
一种子样品制样：每份抽样中随机采集5组样品，每组1g进行后续检测. 苗木及其切花等产品：有明显症状的直接取症状部位1g单独制样，用于后续检测；无明显症状的，可5株混合采样用于后续检测.
7检测鉴定
7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）
把制备的样品上清液加人已包被HVX抗体的酶联板中，进行DAS-ELISA检测.每个样品平行加到两个孔中.健康的植物组织作为阴性对照，感染HVX的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空白对照：其中阴性对照的种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品相一致.
具体操作见附录B.
7.2胶体金免疫层析试纸条检测
胶体金免疫层析试纸条检测的对照设置同7.1，具体操作见附录F.
7.3RT-PCR检测
RNA，反转录合成cDNA后进行PCR检测，具体操作见附录C. RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的总
7.4实时荧光RT-PCR检测
实时荧光RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行实时荧光PCR检测，具体操作见附录D.如采用商品化一 步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行.
7.5RT-LAMP检测
RT-LAMP检测的阴性和阳性对照设置同7.1，灭菌双蒸水作为空白对照.分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行LAMP检测，具体操作见附录E.如采用商品化一步法试剂盒，则 2
按照试剂盒说明进行.
8结果判定
判定按下述原则进行： 样品检测时，首先采用DAS-ELISA或胶体金免疫层析试纸条方法进行初步筛检，检测流程及结果
筛检结果为阳性时：
用RT-PCR进行验证，若验证结果为阳性，则判定样品携带HVX；若验证结果为阴性，再用实时荧光RT-PCR或RT-LAMP进行验证，若验证结果为阳性，则判定样品携带HVX；若验证结果为阴性则判定样品不携带HVX.
或用实时荧光RT-PCR进行验证，若验证结果为阳性，则判定样品携带HVX：若验证结果为阴性，则判定样品不携带HVX.
或用RT-LAMP进行验证若验证结果为阳性则判定样品携带HVX：若验证结果为阴性再用RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行验证，若验证结果为阳性，则判定样品携带HVX：若验证结果为阴性，则判定样品不携带HVX.
一筛检结果为阴性时：
产物进行测序，测定的序列为HVX序列，则判定样品携带HVX.
为阳性，则判定样品携带HVX. 或用实时荧光RT-PCR进行验证，若验证结果为阴性，则判定样品不携带HVX：若验证结果
或用RT-LAMP进行验证验证结果为阴性，判定样品不携带HVX：验证结果为阳性，再用RT-PCR或实时荧光RT-PCR进行验证，若验证结果为阳性，则判定样品携带HVX；若验证结果为阴性则判定样品不携带HVX.
9样品保存与结果记录
9.1样品保存
经检测确定携带HVX的样品应保存在适合的条件下，以备复核.如种子保存在干燥室温环境中；种苗、叶片等样品保存在一80C冰箱中；做好登记和标记工作，保存期限至少1年.
9.2结果记录
记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字.DAS-ELISA检测应有酶联反应数值：胶体金免疫层析试纸条检测应有试纸条检测图片：RT-PCR检测应有电泳图片和测序结果：实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图：RT-LAMP检测应有反应管颜色图片.
