中华人民共和国国家标准
GB/T36808-2018
Detection and identification of Xanthomonas cassavae （ex Wiehe et Dowson)Vauterin et al.
中国国家标准化管理委员会 国家市场监督管理总局 发布
前言
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草.
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口
本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国黄岛出人境检验检疫局、中华人民共和国临沂出人境检验检疫局.
本标准主要起草人：封立平、厉艳、管旭芳、赵丽青、夏明星、伦才智、王简、王英超、吴兴海、邵秀玲.
木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法
1范围
本标准规定了植物检疫中本薯细菌性叶斑病的检疫鉴定方法.本标准适用于木薯繁殖材料中叶、地上茎、幼苗、树干及树枝中木薯细菌性叶斑病菌检疫鉴定.
2规范性引用文件
件.凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括的修改单）适用于本文件. 下列文件对于本文件的应用是必不可少的.凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
GB/T28096-2011木薯细菌性菱病菌检疫鉴定方法
3木薯细菌性叶斑病菌的基本信息
3.1名称
学名 :Xanthomones cassavue (ex Wiehe et Dowson)Vauterin et al.异名 :Xanthowonas ca pestris pv.cassavae ( Wiche &.Dowson 1953) Maraite &.Weyns 1979英名：Cassava leaf spot
3.2分类地位
本薯细菌性叶斑病菌属细菌界 Bacteria，变形菌门 Protcobacteria，变形菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目Xanthomonadales 黄单胞菌科Xanthomonadaceae，黄单胞菌属Xanzhononax.
4方法原理
本薯细菌性叶斑病菌侵染本薯（Manihoresculexfa），主要通过带病的根蒸、叶片等传播，其症状特点（参见附录A）、培养性状和生物学特性（参见附录A）、致病性测定、病原菌分子生物学特征是该病菌的鉴定依据.
5仪器设备
5.1电子天平.5.2生物显微镜：故大倍数40×~1000×.5.3生物安全柜：符合EN12469：2000. 5.4温控培养箱：温控范围5C~50C5.5高压灭菌锅：灭菌工作温度105℃C~138℃，5.6PCR仪：控制精确度±0.25C，温度范围4C~99℃.5.7琼脂糖水平电泳仪. 5.8凝胶成像分析系统.
GB/T 36808-2018
5.9离心机：转速<8000r/min5.10超低湿冰箱：-80℃5.11人工气候箱：控湿范围：相对湿度50%~95%：控温范围：5℃~50℃：光照度：3000lx/12000lx220001x两面光照，五级可调.5.12单道可调微量加样器：适配标准吸嘴2.5μL20μL、100L、1000μL5.13BIOLOGGENⅢ细菌自动鉴定系统（可选） 5.14其他：包括解剖刀、量筒、烧杯、培养皿、三角瓶、离心管、枪头、放大镜、手术剪、镊子、试管、接种环等. 6化学试剂 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水.6.1无水乙醇.6.2乙二胺四乙酸（EDTA）.6.3十二烷基硫酸钠（SDS）.6.4聚乙烯吡咯烷酮.6.6异戊醇. 6.5三氯甲烷，6.7异丙醇.6.8DL2000 DNA Marker.6.9琼脂糖.6.101%次氯酸钠溶液：将1mL次氯酸钠加到100mL蒸馏水中.6.11三烃甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HClpH8.0）：称量121.1gTris置于11烧杯中，加入约800mL的 去离子水，充分搅拌溶解.加入约42mL的浓盐酸调节pH至8.0.将溶液定容至1L.高温高压灭菌后，室湿保存.6.1210mg/mL蛋白酶K溶液：将0.1g蛋白酶K溶解于10mL去离子水中.保存在一20C冰箱里，避免反复冻融.6.136× 上样缓冲液：称量 EDTA 4.4 g、Bromophenol Blue 250 mg、Xylene Cyanol FF 250 mg共置 于500mL烧杯中.向烧杯中加人约200mL的去离子水后，加热搅拌充分溶解.加人180mL的甘油后，使用2mol/L氢氧化钠调节pH至7.0.用去离子水定容至500mL后，室温保存.6.141mol/L氯化镁溶液：溶解20.3g六水氯化镁于足量的水中，定容到100mL.一20℃保存，冰袋运输.6.15dNTP（四管套装，含dATP dCTPdGTP和dTTP4种溶液）：20“C保存，冰袋运输.6.16TaqDNA聚合酶：-20C保存，冰袋运输. 6.1710mg/mL溴化乙锭染色液：称量1g的溴化乙锭，加人到100mL容器中，加人去离子水100mL，充分搅拌数小时完全溶解溴化乙锭.将溶液转移至棕色瓶中，室温避光保存. 7实验室检验 7.1症状检查 首先进行木薯病症观察.该病害可造成木薯生长点的损伤；叶片畸形、坏死、凋萎、黄化，并产生臭2 味：地上茎可发生树皮褪色、溃疡、顶枯、渗液、损伤处附有霉状物、茎内部变色，产生臭味等症状.着重检查叶片，看是否能发现深绿色的水浸角斑或坏死的角斑.在茎的绿色部位寻找小的损伤或溃疡，看能否在损伤和溃疡处发现深绿或深福色的病斑，是否伴有黄色的渗出液.如果在本薯生长的近花期阶段，可观察植株是否有坏疽或顶梢枯死症状.本薯细菌性叶斑病菌在本薯叶片上的侵染症状参见附录A中图A.1和图A.2，本薯细菌性叶斑病菌与近似种木薯细菌性萎嘉病菌在症状上的主要区别参见表A.1. 7.2病菌的分离纯化 7.2.1病组织（病叶或茎段）中病菌的分离 取病健交界处，用1%次氯酸钠溶液处理1min～3min，再用无菌水清洗三次，最后把病组织置放在洁净的载玻片上捣碎，静置10min～20min，用接种环蘸取汁液在NA平板上划线，划3个平板以上，28C下培养3d~5d后，检查并筛选培养基上的菌落.在NA培养基上的菌落为黄色、光滑、奶酪状，质地黏稠.NA培养基的配制方法见附录B中B.1. 7.2.2菌种纯化 采用平板划线法，即用灭菌的移种环雁取NA平板上菌落后，在YDCA培养基上进行多次划线纯化，在28C下温度下培养3d~5d，移出单个菌落后在YDCA培养基上进一步扩大繁殖.在YDCA培养基上的菌落也为黄色、光滑、奶酪状，质地黏稠.YDCA培养基的配制方法见B.2. 7.3生化指标测定 采用BIOLOGGENⅢ细菌自动鉴定系统（Version2.8及以上版本）或应用细菌微量生化鉴定管对可疑菌株进行生化指标的检测. 7.4致病性测定 消毒的接种针上细菌悬浮液，针刺木薯植株的上部幼叶、嫩茎等，每一菌株接种5株，阴性对照用无菌水代替接种液.接种后的植株置放于人工气候箱，在28℃～32℃温度下，先在100%相对湿度保湿24h~48h，然后在80%左右的相对湿度下，每天在7000Ix~10000lx下光照培养16h，黑暗下培养8h.接种7d后开始观察症状，每天观察一次，接种后30d不表现症状的视为不发病.如接种一周后观察到植株上的叶片出现黑绿色水渍角斑，直径0.5mm~1mm，病斑扩散较慢的情况则需进行继续 观察.若2周后出现角斑发展成为坏疽，周围围绕黄色晕环，病斑沿着叶脉扩散并引发整个叶片调菱的症状视为感病. 7.5PCR检测 从本薯组织（叶片或种茎）中抽提总核酸，进行PCR检测分析.或取分离培养的细菌菌落，制成细菌悬浮液，进行PCR检测，无需抽提总核酸.检测方法步骤见附录C. 8结果判定 cassazae特征相符（参见表A.1），致病性测定表现典型症状，本薯病组织分离物DNA的PCR检测结果 若经症状检验并分离的细菌菌株在培养基上的菌落特征与描述相符，生化鉴定结果与Xahomonas
